高内涵成像分析系统筛选(HCS)和高内涵分析(HCA)示例数据

使用新的 CellInsight CX7 Pro 平台实现高通量免疫检测筛选

CellInsight CX7 和 CX7 Pro 仪器之间 FirePlex™-HT 免清洗免疫检测的比较。根据制造商每孔可检测5种和10种分析物的方案，进行了针对高通量筛选的优化免清洗 FirePlex 检测。对10点标准曲线进行定量，以测定分析物的重现性和动态范围窗口。生成的检测可使用 CellInsight CX7 (左图像) 或 CX7 Pro (右图像) 平台进行测量，并使用 FirePlex Analysis Workbench 软件进行定量。只有 CX7 Pro 仪器 (右图) 能够超过2.5(15位)或3.0(16位)的动态范围且不到 15% 的板内 CV。CX7 Pro 仪器出色的光学系统和 95% 的 QE 检测能力显著改善了动态范围和可重现性的性能表现。使用15位和16位 CX7 Pro sCMOS 相机模式的 Abcam™ 对此实验进行了验证，以了解高通量筛选的相关考虑。

免疫肿瘤学应用： 乳腺癌球状体中抗体依赖细胞杀伤的成像

乳腺癌球状体中抗体依赖的细胞杀伤。 通过  Dynabeads Untouched 人 NK 细胞试剂盒 分离的人天然杀伤细胞使用  CellTracker Deep Red 染料标记。在 Nunclon Sphera 96 孔板中隔夜培养人乳腺癌细胞 (SKBR3) 以形成球状体，用 HER2 抗体 Trastzumab 处理，然后用 NK 细胞攻击 4 小时。使用  CellEvent 半胱天冬酶-3/7 绿色荧光检测试剂 和 Hoechst 33342 染色细胞，并在 CellInsight CX7 LZR 高内涵筛选平台上成像。图像是多个 Z 切片的最大强度投影。CellEvent 半胱天冬酶-3/7 绿色荧光检测试剂可用于研究球状体中的 NK 细胞和抗体介导的细胞凋亡。CellTracker 深红染料用于追踪球状体内的 NK 细胞。与 SKBR3 细胞上 HER2 结合的 Trastzumab，通过抗体依赖性细胞凋亡扩大 NK 细胞的抗肿瘤反应。

球状体成像和分析应用：EdU 增殖和球状体大小的分割和定量

使用 CellInsight CX7 LZR 系统进行 EdU 分割和定量与确定球状体大小。 以 5,000 个细胞 / 孔的密度将 A549 细胞接种到 Nunclon Sphera 96U 孔微孔板上，并在 CO2 培养箱中培养 24 小时。添加 EdU 到 10 μM 的最终浓度并培养 1 小时。然后用 4% 甲醛洗涤和固定球状体，并用 0.25% 的 Triton X-100 渗透。然后用  Click-iT EdU Alexa Fluor 488 HCS 检测试剂盒 按使用说明染色球状体以显示 EdU。在 CellInsight CX7 LZR 高内涵筛选平台上，以共焦模式在 4x 物镜下对板成像。图像是 200 个光学 z- 切片（每个 1 微米）的最大强度投影。定量采用 HCS Studio 2.0 软件的 Morphology Explorer 生物应用进行。将球状体分割为一个对象，并按球状体内点计数 EdU 阳性细胞。使用 Morphology Explorer 生物应用将球状体分割为一个对象，并对球状体内的 EdU 阳性细胞分割，然后绘制细胞数。

用于生物应用的活细胞模式下 3D 球状体的共焦成像

活细胞模式下 3D 球状体的共焦成像。 (A) 以 5,000 个细胞 / 孔的密度将 A549 细胞接种在 U 形底微孔板上，并在 CO2 培养箱中培养 48 小时。用 LIVE/DEAD 细胞活力/ 细胞毒性试剂盒标记活球状体的活细胞和死细胞。在 CellInsight CX7 LZR HCS 仪器上的共聚焦模式下使用 10 倍物镜对板自动成像。图像是多个 Z 切片的最大强度投影。球状体核心观察到死细胞（红色），并在外周观察到活细胞（绿色）。 (B) 以 5,000 个细胞 / 孔的密度将 A549 细胞接种在 U 形底微孔板上，并在 CO2 培养箱中培养 24 小时。然后使用  MitoTracker Orange CMTMRos  和  CellEvent 半胱天冬酶-3/7 绿色荧光检测试剂 对活球状体染色 30 分钟。在 CellInsight CX7 LZR HCS 仪器上的共聚焦模式下使用 10 倍物镜对板自动成像。图像是多个 Z 切片的最大强度投影。在 A549 活球状体中，MitoTracker Orange 染色显示大部分细胞健康，并观察到极少数凋亡细胞。 (C) 以 5,000 个细胞 / 孔的密度将 A549 细胞接种在 U 形底微孔板上，并在 CO2 培养箱中培养 24 小时。然后用  Image-iT 绿色低氧试剂 对活球状体染色 30 分钟。在 CellInsight CX7 LZR HCS 仪器上的共聚焦模式下使用 10 倍物镜对板自动成像。图像是多个 Z 切片的最大强度投影。活 A549 球状体在使用 Image-iT 绿色低氧试剂染色后显示出低氧染色。 (D) 以 5,000 个细胞 / 孔的密度将 SKBR3 细胞接种在 U 形底微孔板上，并在 CO2 培养箱中培养 24 小时。然后将活球状体与 pHrodo 红偶联的 Herceptin 抗体培养 24 小时。在 CellInsight CX7 LZR HCS 仪器上的共聚焦模式下使用 4 倍物镜对板自动成像。图像是多个 Z 切片的最大强度投影。胞内囊泡中观察到内化的 pHrodo 红偶联的 Herceptin 抗体。 (E) 使用  Neurobasal Plus 培养基 及 Culture One 添加剂从神经干细胞 (NSC) 中分化神经球。然后用 微管蛋白Tubulin Tracker Deep Red  染色活神经球 1 小时。在 CellInsight CX7 LZR HCS 仪器上的共聚焦模式下使用 4 倍物镜对板自动成像。图像是多个 Z 切片的最大强度投影。微管蛋白 Tracker Deep Red 染色从 NSC 分化的神经球中的神经突。 (F) 以5,000个细胞/孔的密度将 HeLa 细胞接种在 U 形底微孔板上，并在 CO2 培养箱中培养24小时。使用  CellTracker Deep Red 标记已活化的 T 细胞，且在每孔中加入约 5,000 个细胞。培养活化 T 细胞 2 小时后，使用  pHrodo Green AM 胞内 pH 指示剂 染色球状体 30 分钟。然后用 PBS 洗涤细胞 3 次，并在 CellInsight CX7 LZR HCS 仪器上的共聚焦模式下使用 4 倍物镜成像。图像是多个 Z 切片的最大强度投影。添加活化 T 细胞后，胞内 pHrodo Green AM 荧光增加。

球状体内增殖细胞的成像和分析

分析 HeLa 球状体中的增殖细胞。 以 5,000 个细胞 / 孔的密度将 HeLa 细胞接种在 Nunclon Sphera U 形底微孔板上，并在 CO2 培养箱中培养 24 小时。球状体用 50 μM 羟基尿素处理 24 小时然后用 10 µm 5- 乙炔基 -2 '- 脱氧尿苷 (EdU) 脉冲洗涤球状体 30 分钟。然后用 PBS 洗涤球状体，并使用  Click-iT EdU Alexa Fluor 488 HCS 检测试剂盒染色增殖细胞。然后用与 Alexa Fluor 647 染料偶联的 Ki67 抗体洗涤并染色球状体。在 CellInsight CX7 LZR HCS 仪器上的共聚焦模式下使用 10 倍物镜对球状体自动成像。图像是多个 Z 切片的最大强度投影。将球状体分割为一个对象，并定量球状体内的 EdU 和 Ki67 阳性细胞点。对照球状体中均可见 EdU 和 Ki67 阳性细胞。羟基脲处理球状体中，活跃增殖的 s 相细胞消失（ EdU 阴性），仅观察到 Ki67 阳性细胞。

免疫肿瘤学应用：T 细胞穿透和杀死肺癌球状体的成像

T 细胞穿透和杀死肺癌球状体。 在使用 Gibco 最小必需培养基 (MEM) 的 Nunclon Sphera U 型底板中接种 A549 细胞，并培养 2 天。使用  Dynabeads 人 T-Expander CD3/CD28  活化从人 PBMC 中分离的 T 细胞 72 小时，并用 CellTracker Deep Red 染料 标记 4 小时，然后添加到加入肺癌球状体中。使用  CellEvent 半胱天冬酶 3/7 试剂标记细胞。在 CellInsight CX7 LZR 高内涵平台上，通过活细胞全球状体成像评估 T 细胞渗透和肿瘤细胞毒性。使用 CellEvent 半胱天冬酶 3/7 试剂（绿色）增强染色后，可见活化 T 细胞穿透球状体（红色）并在整个球状体中的靶细胞内诱导细胞凋亡。