专利的pH敏感性Invitrogen pHrodo染料在中性pH值时几乎不发荧光，而在酸性环境下可发出明亮的荧光，这种特性使pHrodo成为许多应用的理想pH指示剂。pHrodo染料有红色和绿色两种可选，使您可以在进行其他细胞检测的同时，也可以进行多重pH测定。pHrodo染料可用于检测细胞质或细胞亚结构内的胞内pH。由于其在中性pH值下几乎不发荧光，而且任何非内化的染料基本也不发荧光，省去了洗涤步骤和染料淬灭的必要。
pHrodo染料可用于如下应用：
使用pHrodo指示剂检测细胞内pH值。使用Invitrogen pHrodo Green AM细胞内pH指示剂和Invitrogen pHrodo Red 10,000 MW Dextran标记小鼠J774A.1巨噬细胞。使用Intracellular pH Calibration Buffer Kit将pHi调整至指定数值。
检测细胞质pH
检测吞噬作用
检测配体内化过程
随机胺基活性标记
位点特异性抗体标记
抗体内化筛选工具
延时成像显示 pHrodo E. coli BioParticles偶联物在小鼠J774A.1细胞吞噬作用中的内化和酸化过程。使用561 nm激光激发，记录570–699 nm发射光范围内的荧光成像，并同时在另一个 PMT上记录白光DIC图像。采用带有63×(NA 1.4)油镜的Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜在共振检流计扫描器模式下(8000 Hz)采集图像，每30秒采集一次，共采集83.8分钟 (未显示所有图像)。该图像由芝加哥大学的Lucy Deriy和Deborah Nelson提供。
检测细胞质pH
检测吞噬作用
检测配体内化
检测内吞作用
随机胺基活性标记
位点特异性抗体标记
抗体内化筛选工具
pHrodo染料用于流式细胞分析。利用pHrodo标记的细菌使其不仅仅适用于酶标仪和显微镜成像平台，也同样适用于流式细胞仪。在此过程中，流式细胞分析数据表明被 pHrodo标记的大肠杆菌E. coli处理后的粒细胞荧光信号显著增强了。采集全血样本并用肝素处理，分成两个100 µL等份。两个等分小包装样本都用pHrodo标记的E. coli处理并旋旋涡混匀。将其中一份样本置于 37°C 水浴中，另一份样本 (阴性对照) 置于冰上。样本经过红细胞裂解和离心，用 FACSCalibur流式细胞仪 (BD Biosciences) 488 nm氩激光和564-606 nm发射滤光片通道进行分析。（左图） 使用前向与侧向散射对粒细胞进行设门选定。（右图）孵育于37°C中的样本显示胞内 pHrodo染料标记E. coli （红色）的荧光增强，与放置在冰浴中抑制吞噬（蓝色）的阴性对照样本形成鲜明对比。
检测细胞质pH
检测吞噬作用
检测配体内化过程
检测内吞作用
随机胺基活性标记
位点特异性抗体标记
抗体内化筛选工具
使用pHrodo Red Zymosan Bioparticles观察吞噬抑制因子细胞松弛素D对RAW细胞的剂量依赖反应和固定对细胞的影响。RAW巨噬细胞接种在完全培养基上并过夜培养。第二天，使用 1X活细胞成像溶液洗涤细胞，然后加入20 μL包含吞噬抑制因子细胞松弛素D的活细胞成像溶液替代原有完全培养基在 37°C 下孵育15分钟，其中细胞松弛素D的浓度分为8个剂量反应点，浓度范围为10 μM 至 3 pM，每个浓度做三个重复。Bioparticles被重悬于2X工作浓度的活细胞成像溶液中，含浓度为2 mg/mL（E. coli和staph）或1 mg/mL（Zymosan）。将重悬液加入细胞，然后将培养板重新放回37°C孵育90分钟，使吞噬过程完全。使用FlexStation酶标仪在 490 Ex/525 Em下进行读板测定，pHrodo Green particles粒采用515 cutoff，pHrodo Red particles采用590 cutoff。通过加入等体积的8% PFA进行固定，多聚甲醛终浓度为4%。
检测细胞质pH
检测吞噬作用
检测配体内化过程
随机胺基活性标记
位点特异性抗体标记
抗体内化筛选工具
延时成像显示 pHrodo E. coli BioParticles偶联物在小鼠J774A.1细胞吞噬作用中的内化和酸化过程。使用561 nm激光激发，记录570–699 nm发射光范围内的荧光成像，并同时在另一个 PMT上记录白光DIC图像。采用带有63×(NA 1.4)油镜的Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜在共振检流计扫描器模式下(8000 Hz)采集图像，每30秒采集一次，共采集83.8分钟 (未显示所有图像)。该图像由芝加哥大学的Lucy Deriy和Deborah Nelson提供。
检测细胞质pH
检测吞噬作用
检测配体内化
检测内吞作用
随机胺基活性标记
位点特异性抗体标记
抗体内化筛选工具
pHrodo染料用于流式细胞分析。利用pHrodo标记的细菌使其不仅仅适用于酶标仪和显微镜成像平台，也同样适用于流式细胞仪。在此过程中，流式细胞分析数据表明被 pHrodo标记的大肠杆菌E. coli处理后的粒细胞荧光信号显著增强了。采集全血样本并用肝素处理，分成两个100 µL等份。两个等分小包装样本都用pHrodo标记的E. coli处理并旋旋涡混匀。将其中一份样本置于 37°C 水浴中，另一份样本 (阴性对照) 置于冰上。样本经过红细胞裂解和离心，用 FACSCalibur流式细胞仪 (BD Biosciences) 488 nm氩激光和564-606 nm发射滤光片通道进行分析。（左图） 使用前向与侧向散射对粒细胞进行设门选定。（右图）孵育于37°C中的样本显示胞内 pHrodo染料标记E. coli （红色）的荧光增强，与放置在冰浴中抑制吞噬（蓝色）的阴性对照样本形成鲜明对比。
检测细胞质pH
检测吞噬作用
检测配体内化过程
检测内吞作用
随机胺基活性标记
位点特异性抗体标记
抗体内化筛选工具
使用pHrodo Red Zymosan Bioparticles观察吞噬抑制因子细胞松弛素D对RAW细胞的剂量依赖反应和固定对细胞的影响。RAW巨噬细胞接种在完全培养基上并过夜培养。第二天，使用 1X活细胞成像溶液洗涤细胞，然后加入20 μL包含吞噬抑制因子细胞松弛素D的活细胞成像溶液替代原有完全培养基在 37°C 下孵育15分钟，其中细胞松弛素D的浓度分为8个剂量反应点，浓度范围为10 μM 至 3 pM，每个浓度做三个重复。Bioparticles被重悬于2X工作浓度的活细胞成像溶液中，含浓度为2 mg/mL（E. coli和staph）或1 mg/mL（Zymosan）。将重悬液加入细胞，然后将培养板重新放回37°C孵育90分钟，使吞噬过程完全。使用FlexStation酶标仪在 490 Ex/525 Em下进行读板测定，pHrodo Green particles粒采用515 cutoff，pHrodo Red particles采用590 cutoff。通过加入等体积的8% PFA进行固定，多聚甲醛终浓度为4%。
pHrodo指示剂是什么？
pHrodo染料是一种新型荧光染料，当其周围环境pH值降低时，它会显著增强荧光亮度。pHrodo Green染料及其偶联物最佳吸收波长和最大发射波长分别约为509 nm和533 nm，pHrodo Red染料则分别为560 nm和585 nm。pHrodo Green染料与pHrodo Red染料均可由488 nm氩离子激光器激发，大部分的流式细胞仪、显微镜、和酶标仪仪器均配有这一光源。
pHrodo Red（左图）与pHrodo Green（右图）染料荧光发射光谱。pHrodo染料标记的E. coli 的荧光发射光谱在一系列的50 mM磷酸盐缓冲液中测定，缓冲液pH值由4至10。E. coli浓度为0.1 mg/mL，使用 Hitachi F4500荧光计在532 nm 激发波长下读值。
资源
手册
科学海报
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BioProbes 期刊文章
BioProbes 69: pHrodo Dextrans的新应用
BioProbes 70: 检测活细胞内pH—pHrodo作为pH传感器检测胞质和囊泡pH
仅供科研使用，不可用于诊断目的。