PCR方法—常用的10种策略

表 1.常用PCR方法及其核心优势。

热启动PCR常用于增强PCR扩增的特异性。该方法主要利用抗体、亲合配体、适体或化学修饰物等酶修饰酶，来抑制室温下的DNA聚合酶的活性。这种修饰使得在PCR体系配制阶段引物与模板、引物与引物之前的结合能力降低，从而避免了非特异性扩增。由于DNA聚合酶在室温下的活性被抑制，所以，热启动技术为在室温下配制多个PCR反应体系提供了极大的便利，，且不会影响特异性和扩增能力（了解关于 DNA 聚合酶特点的更多信息）。

当反应体系配制好后，在反应初始加热阶段或“热启动”阶段，酶修饰物在高温下（通常高于90 ℃）被释放，使得DNA聚合酶被激活（图1）。具体激活时间和温度取决于DNA聚合酶以及热启动修饰物的性质。对某些DNA聚合酶而言，有时激活和起始变性步骤可以合并为一步。

图 1.基于抗体热启动技术的DNA聚合酶。

另一种提高PCR反应特异性的方法是调整PCR循环的参数。在降落PCR中，前面几个循环的退火温度设定为比引物的最高熔解温度（T_m）再高几度[1,2]。较高的温度有助于避免产生引物二聚体及非特异性引物-模板复合物的形成，因此可减少不希望出现的扩增。因此，在PCR起始阶段提高退火温度，可减少非特异性PCR产物，增加特异性扩增（了解关于 PCR 退火步骤的更多信息）。

需要注意的是，虽然较高的退火温度能够防止引物二聚体形成和非特异性引物结合，但同时也可能加剧引物与目的序列的解离，从而降低PCR得率。为克服这一问题，在最初几个循环中，通常会将每个循环的退火温度降低1°C，以获得足量的目标扩增子。一旦退火温度达到或“降落”至最佳温度（通常比最低引物T_m低3-5°C），剩下的循环都维持此退火温度。通过这种方法，在PCR过程中，所期望的PCR产物得到有选择性的增加，同时保证很少或不发生非特异性扩增(图 2)。

图 2：降落PCR该方法通过采用高于最佳退火温度的起始温度，之后随着循环逐渐降温（黑线），直至达到最佳退火温度，来提高特异性（黄色曲线）。退火温度不断优化，目标扩增子的得率（绿色曲线）不断累积。

巢式PCR是标准PCR的一种演变，其增强了反应特异性和目标扩增子的产量[3]。在此方法中，需要设计两对PCR引物：一对（外引物）在目标扩增区域的侧翼，另一对（巢式引物）对应于待扩增的DNA区域。其中，外引物用于第一轮PCR，以扩增含有延伸侧翼区域的区域。随后，巢式引物用于第二轮PCR，并以第一轮PCR产物为模板（图 3）。

图 3.巢式PCR

如果第一对引物（外引物）的错配导致非特异性产物被扩增，相同的非特异性区域被第二对引物识别并继续扩增的可能性非常小，所以通过第二对引物的扩增，PCR的特异性得到了提升。进行两轮PCR的一个优势在于：有助于从有限的起始DNA中扩增得到足量的产物。

在快速PCR中，通过缩减PCR步骤所需时间来完成更快的扩增，且不会影响扩增产量和效率。快速循环条件尤其适用于具有高扩增能力的DNA聚合酶，这类聚合酶在每个结合中可引入更多的核苷酸（了解关于 合成能力的更多信息）。高合成能力 Taq 聚合酶所需的延伸时间仅占低合成能力Taq聚合酶所需时间的1/2至1/3，却能维持较高的扩增效率（图4）。此外，如果引物的退火和延伸温度相差无几，则可将它们合并为一步，以进一步缩短PCR时间。这一过程也被称为 两步PCR法。

当使用低合成能力的 Taq 聚合酶时，如Taq聚合酶，快速循环条件可能适用于 <500 bp左右的短片段。扩增如此大小的片段通常不需要延长聚合时间，因此可缩短PCR方案中的延伸步骤时间。为确定最短延伸时间，同时又不损失产物得率，可采用一系列延伸时间递减的方式（几秒）优化PCR。每个目的片段和引物对都可能会产生变化结果，所以需要在特定条件下对快速PCR进行优化。

快速PCR的另一种调整方式是缩短变性时间，将变性温度提高至98°C。使用这种策略时应注意，非高度热稳定的酶在这种高温环境下易于变性（了解关于 DNA 聚合酶热稳定性的更多信息）。

表 2.使用低合成能力DNA聚合酶实现快速PCR时所用的反应参数。

使用可实现快速循环的 热循环仪 和薄壁 PCR 管，分别有助于实现快速变温和高效热转移，从而能够大大加速PCR。

直接PCR是指直接从样品扩增目标DNA，无需进行核酸分离纯化。直接PCR中，在高温变性阶段，诸如细胞、组织等材料在特殊的缓冲液中被裂解，释放出DNA。因此这种方法简化了实验流程，减少了动手操作时间，同时可避免纯化步骤DNA的损失（图 5）。

图 5.常规PCR和直接PCR对比。

推荐使用具有 高合成能力 的DNA聚合酶用于直接PCR扩增。细胞碎片、蛋白、脂质和多糖也随DNA一起被释放到裂解液中，它们会抑制PCR反应。而具有高合成能力的DNA聚合酶能够耐受这类抑制剂，使直接PCR扩增成为可能。具有高合成能力的酶通常具有更高的灵敏度，因此可从未纯化的样品中成功扩增微量DNA。

具有高GC含量（>65%）的DNA模板由于G和C碱基间的强氢键影响，比较难以扩增。富含GC的序列同时也涉及二级结构。因此，富含GC的序列可导致DNA聚合酶沿模板扩增时“卡顿”并干扰DNA合成。

为了扩增高GC含量的片段，双链模板必须解离，以便引物与模板结合，并使DNA聚合酶能够读取到序列。为了克服强GC相互作用，最常用的方法是使用DMSO等 PCR添加剂或辅助溶剂 来帮助DNA变性（图 6A）。然而，这些试剂通常会降低引物的 T_m，所以退火温度也需进行相应的调整。

高合成能力的DNA聚合酶由于与模板的结合能力更强，有利于完成高GC含量PCR（图 6B）。超高热稳定性DNA聚合酶也有利于高GC含量PCR，因为较高的变性温度（如，使用98°C代替95°C）可能会促进双链解离和PCR扩增（了解关于 PCR循环的更多信息）。

图 6.不同GC含量人类gDNA区域的扩增。（A）使用低合成能力DNA聚合酶扩增GC含量为76%的~0.8 kb靶标。增加DMSO添加剂的用量，可提高特异性。（B） 使用 高合成能力DNA聚合酶扩增GC含量不同的七个片段。只有GC含量为70%和76%的片段使用GC增强剂。

多重PCR可在同一PCR反应管中同时扩增多个不同的片段。多种PCR不仅意味着节省时间、试剂和样品，还能够同时对比多个扩增子（图 7）。 

图 7.单个PCR和多重PCR的比较。在单个PCR中，每个反应使用一个引物对扩增一个目的片段。而在多重PCR中，每个反应使用多个引物对扩增多个目的片段。

当一个PCR管中有多个引物对时，如在多重PCR中，因无法仅针对一个引物对或目的片段进行反应优化，而是要考虑到所有引物和靶标，所以可能会出现非特异性扩增和效率降低。因此，为尽量减少由非特异性扩增导致的错配，应对引物进行精心设计。首先，引物序列应尽可能与其目的序列一一对应，并且所有引物的 T_m相差不应超过5°C。在多重PCR开始前，应利用单个PCR反应验证每个引物对的特异性和扩增效率。此外，扩增子应具有不同的大小，从而能够通过凝胶电泳对其进行分离鉴定。除了引物设计和扩增子大小，使用热启动DNA聚合酶和专为多重PCR设计的缓冲液也将有助于获得成功的PCR结果和提高反应特异性（图8）。

图 8.通过凝胶电泳对比单个和多重PCR结果。该实验中使用Invitrogen™ Platinum™ 多重PCR预混液。

尽管多重PCR常作为终点法PCR，但由于其在多重标记和检测中的能力 ，将其用于实时荧光定量PCR也变得越来越流行。另外，多重实时荧光定量PCR也常被用于遗传标志物的检测，用于 人类身份鉴定。

长片段PCR通常是指扩增大于5kb的DNA片段。长片段PCR传统上使用 Taq DNA 聚合酶（用于快速延伸）和高保真酶（用于提高准确性）的混合物。

随着具有 高合成能力的高保真DNA聚合酶被发明出来，现在能够在更短的时间内实现更准确的长片段PCR。通过在DNA聚合酶中设计一个较强的DNA结合结构域，从而使其能够在短时间内扩增长片段（如，来自gDNA的 >20 kb 片段），实现高合成能力（图9, 表 3）。此外，极高的保真度（如， Taq 聚合酶保真度的 >100倍）还有助于确保长片段扩增的低错误率（表 3）。（了解关于 DNA聚合酶特点的更多信息。）

表 3.在长片段PCR和克隆中使用 高合成能力高保真DNA聚合酶 的优势。

DNA聚合酶的高合成能力可显著缩短长片段PCR的反应时间（在本例中，时间缩短了一半），而高保真度可减少筛选含正确插入片段克隆的工作量。

当扩增>10 kb的目的片段时，应根据以下5个关键点对PCR方案进行优化：

1. 确保使用高质量、高纯度的DNA样本。
2. 如果DNA聚合酶的热稳定性较低，则需要使用更多量的酶，以弥补因延长循环时间导致的活性损失。
3. 降低退火和延伸步骤的温度，有助于引物结合。
4. 适当延长PCR步骤的持续时间，有助于模板DNA的完全解离及引物的结合。
5. 适当延长PCR延伸时间，可确保目标区域的全长复制。
    

反向PCR起初设计用于确定邻近未知区域的序列。它有助于研究基因的启动子序列；致癌性染色体重排，如基因融合、易位和转座；以及病毒基因整合。该方法之所以被称为反向PCR，是因为引物设计用于向两边延伸而不像常规PCR中朝着彼此延伸。[4,5]。如今，反向PCR常被用于 定点突变 ，复制一个具有预期突变的质粒。

在研究基因组DNA未知序列的传统工作流程中，首先进行限制性酶切消化和连接，再进行反向PCR，随后对PCR扩增子进行测序。对于gDNA消化，需选用一种限制性内切酶进行酶切，以获得长度合适且能够自我连接的片段。同时，选定的限制性内切酶不可剪切已知序列，从而使连接发生于侧翼未知序列之间。使用低浓度的酶切DNA片段优化连接步骤，使其倾向于自我连接而非多片段连接（即形成连环体）。

完成自我连接后，从DNA的已知区域启动反向PCR。所获得的扩增子每个末端都含有部分已知DNA序列。随后，可从末端开始对这些扩增子进行测序，检测上述已知序列的相邻区域（图 10）。

图 10.用于扩增和鉴定邻近未知序列的反向PCR。

序列的扩增程度（得率）取决于模板起始量，PCR常用于对样品中的DNA进行定量，其中，最常见的应用是 基因表达定量。终点PCR方法虽然可行，但它存在一重大缺点，即需要通过凝胶电泳确定得率，从而限制了检测灵敏度。此外，定量是在PCR末期进行的，而此时的扩增已达到平台期（图11），因此，DNA凝胶染色强度无法与DNA起始量呈线性相关。尽管如此，若在到达平台期之前通过终点PCR对基因表达进行半定量分析，可使用连续稀释的DNA样品作为起始物，或收集指定PCR循环的扩增子，并根据凝胶染色强度估计基因表达量[6,7]。 

图 11.PCR的扩增曲线或反应动力学。在终点PCR中，在扩增到达平台期时对扩增子进行检测。而在实时荧光定量PCR中，是在指数增长期对扩增子进行定量。
 

直到1993年，Higuchi等报道称使用荧光信号对PCR扩增进行实时监测，才克服了终点PCR定量的局限性[8]。这一技术为我们今天所熟知的 定量PCR(qPCR）奠定了基础。1997年，第一款qPCR仪进入市场[9,10]，使PCR能够准确定量基因表达和拷贝数。qPCR依靠对指数期目的片段扩增荧光信号的实时监测（图 11），克服了终点PCR定量的缺点。尽管qPCR能够定量检测相对和绝对基因表达，但是其检测能力限制了定量性能。

20世纪90年代与实时荧光定量PCR同时开发的 数字PCR （也称为极限稀释PCR）实现了真正的DNA样品绝对定量[11-13]。在数字PCR中，是将高度稀释的DNA样品分配到多区室芯片中，使每个区室最多含有一个拷贝的靶标。然后，对每个区室内的扩增进行检测，获得阳性或阴性结果（分别为1或0个模板拷贝；即， "数字" 结果）。最后，使用统计模型（泊松分布），根据阴性反应部分确定样品的拷贝数，无需定量已知样品（标准品）（图12）。除了基因表达和拷贝数定量，数字PCR还适用于区分低频等位基因、病毒滴定以及下一代测序文库的绝对定量等应用。

图 12.利用数字PCR进行绝对定量的一般工作流程。
 

总之，改进的PCR实验方案和改进的DNA聚合酶旨在改善PCR扩增的结果。虽然PCR的基础概念并未发生改变，但新型PCR方法将继续推动和简化分子生物学研究。

1. Don RH, Cox PT, Wainwright BJ (1991) 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.Nucleic Acids Res19(14):4008.
2. Hecker KH, Roux KH (1996) High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.Biotechniques20(3):478–485.
3. Haff LA (1994) Improved quantitative PCR using nested primers.PCR Methods Appl3(6):332–337.
4. Ochman H, Gerber AS, Hartl DL (1988) Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction.Genetics120(3):621–623.
5. Pavlopoulos A (2011) Identification of DNA sequences that flank a known region by inverse PCR.Methods Mol Biol772:267–275.
6. Raeymaekers L (1999) General Principles of Quantitative PCR.In: Kochanowski B, Reischl U (editors), Quantitative PCR Protocols.Totowa, NJ: Humana Press. pp. 31–41.           
7. Siebert PD (1999) Quantitative RT-PCR.In: Kochanowski B, Reischl U (editors), Quantitative PCR Protocols.Totowa, NJ: Humana Press. pp. 61-85.    
8. Higuchi R, Fockler C, Dollinger G (1993) Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions.Biotechnology (N Y)11(9):1026–1030.
9. Wittwer CT, Ririe KM, Andrew RV (1997) The LightCycler: a microvolume multisample fluorimeter with rapid temperature control.Biotechniques22(1):176–181.
10. Applied Biosystems, Inc. (1997) Relative quantitation of gene expression: ABI PRISM 7700 Sequence detection system.User Bulletin #2: Rev B part 4304859B, 1–36.
11. Sykes PJ, Neoh SH, Brisco MJ et al.(1992) Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.Biotechniques13(3):444-449.
12. Kalinina O, Lebedeva I, Brown J et al.(1997) Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.Nucleic Acids Res25(10):1999–2004.
13. Vogelstein B, Kinzler KW (1999) Digital PCR.Proc Natl Acad Sci U S A 96(16):9236–9241.