PCR实验组成——六大需要考虑的关键成分

用于复制的PCR模板可以是任何DNA来源，如基因组DNA（gDNA）、互补DNA（cDNA）和质粒DNA。不过，DNA的组成或复杂度会影响PCR扩增的最佳起始量。例如，在起始量为50 µL 的PCR中，只需0.1–1 ng质粒DNA，而gDNA则需要5–50 ng。最佳模板起始量还取决于所使用的 DNA 聚合酶类型；经过改造的DNA聚合酶对模板的亲和力更强，灵敏度更高，所需的DNA起始量更少。对DNA起始量的优化很重要，因为起始量过高会增加发生非特异性扩增的风险，而起始量过低会降低得率（图 1）。

有时候，PCR实验方案会使用拷贝数表示DNA起始量，特别是gDNA。拷贝数的计算取决于分子的数量，即DNA起始摩尔量。用Avogadro常数（L）和摩尔质量计算拷贝数，公式如下：

拷贝数=L x 摩尔数 = L x （总质量/摩尔质量）

特定DNA链的摩尔质量取决于其大小或总碱基数（即，其长度和单链或双链特性的组合）。为了简便，可使用 在线工具 从起始DNA的质量计算拷贝数。

理论上，单拷贝DNA或单个细胞在理想条件下足够用于PCR扩增。但在实际情况中，特定模板量的扩增效率很大程度上取决于反应组分和反应参数，以及DNA聚合酶的灵敏度。

除了gDNA、cDNA和质粒DNA，可通过再次扩增PCR产物，得到更高的目标DNA得率。尽管未纯化的PCR产物可以直接再次用作模板，但是引物、dNTP、盐和副产物等遗留反应成分会对扩增造成不利影响。为了避免这种抑制作用，通常建议在下一轮PCR前用水稀释反应。如需获取最佳结果，应在再次扩增前将PCR扩增子进行纯化。使用经优化的 PCR纯化试剂盒，仅需5分钟即可完成PCR产物纯化步骤。

DNA聚合酶在目标DNA的复制中至关重要。TaqDNA 聚合酶应该算是最广为人知的PCR聚合酶了——它的发现 彻底改变了PCR。TaqDNA 聚合酶具有相对较高的热稳定性，在 95°C下的半衰期约为40分钟[1]。在70°C时能够以每秒60个碱基的速度引入核苷酸，扩增长度约为5 kb，因此，它适用于无特殊要求的常规PCR。如今， 新一代DNA聚合酶 经过改进，PCR性能有了明显改善。

一般在50µL 反应中，1-2单位的DNA聚合酶已足够用于目标DNA的扩增。但是，对于难扩增模板，则需要调整酶的使用量。例如，当DNA样品含有抑制剂时，增加DNA聚合酶使用量有助于提高PCR得率。但是注意，提高酶浓度可能会产生非特异性PCR产物（图 2）。

对于PCR克隆、长片段扩增和高GC含量PCR等更为特殊的应用，应该使用 性能更高的DNA 聚合酶。这些酶能够在短时间内从长模板上扩增出PCR产物，错误率更低，得率更高，对抑制剂的耐受性更强（了解关于 DNA 聚合酶特性的更多信息）。

PCR引物是含有15-30个碱基的合成DNA寡核苷酸。能够与模板DNA中目标区域的侧翼序列结合（通过序列互补）。在PCR反应期间，DNA聚合酶从 3′端开始延伸引物。因此，引物结合位点必须是靶标附近所特有的，并且与起始DNA的其它部分序列具有最小的同源性，以确保目的片段的特异性扩增。

除了序列同源性，引物还必须考虑到其它相关问题，，以确保PCR扩增的特异性。首先，引物序列的熔解温度（T_m）必须在 55–70°C之间，两种引物的 T_m相差不超过 5°C。同样重要的是，引物的序列不能具有互补性（特别是3’末端），若两个引物互补会促进退火（即，引物二聚体），自我互补会导致自我配对（即，二级结构），或序列的直接重复会导致与模板目标区域产生不完全配对。

此外，引物的GC含量最好在40-60%之间，均匀的C和G分布能够避免错误发生。同样，为了尽量减少非特异性，引物3′端最多只能含有3个G或C碱基。另一方面，引物3′端含有1个C或G核苷酸有利于引物的锚定和延伸（表 1）。为了简便，有多种 在线工具 可用于设计以及选择具有指定参数的最佳引物序列。

表 1.PCR引物设计的一般建议。

长序列引物（如， >50 nt）或碱基经修饰的引物通常需要进行 纯化 ，以去除非全长产物和未结合的核苷酸。对于分子克隆和突变等应用，建议将引物进行纯化，序列和长度的完整性对于实验的成功至关重要。

为PCR克隆设计引物时，可在5'末端引入限制性酶切位点、重组序列和启动子结合位点等延伸的非模板序列。这些延伸序列需进行精心设计，以尽量减小对PCR扩增和下游实验应用的影响（了解关于 PCR克隆的更多信息）。

在配制PCR反应体系时，引物加入量应在0.1–1 μM范围内。对于含有简并碱基或用于长片段PCR扩增的引物，常用的引物浓度为0.3–1 μM 。通常，建议先使用标准浓度，然后根据需要再进行调整。引物浓度过高容易产生错配和非特异性扩增。而引物浓度过低可能会导致目的片段的少量扩增或无扩增（图 3）。

图 3.使用不同浓度的引物对人类gDNA进行PCR扩增。 在该实验中，对富含GC的0.7 kb片段进行扩增。可以观察到，在高引物浓度下，会产生非特异性产物和引物二聚体。

dNTP由四个基本核苷酸组成——dATP、dCTP、dGTP和dTTP——是新DNA链的组成元件。这四种核苷酸通常以相等摩尔量加入到PCR反应体系中，以实现最佳的碱基引入。但是，在某些情况下，如通过PCR方法进行随机突变，偶尔也会使用浓度不等的dNTP，以促进非校正DNA聚合酶产生更多的错误碱基插入。

在常见的PCR应用中，各种dNTP的常用终浓度通常为0.2 mM。有时，使用高浓度dNTP也可能也是有益的，特别是在存在高浓度 Mg²⁺的情况下，因为Mg²⁺ 可与dNTP结合，减少可被引入的dNTP量。但同时，当dNTP超过最佳浓度时，会抑制PCR反应。为使DNA聚合酶完成有效扩增，反应中的游离dNTP浓度不得超过 0.010–0.015 mM（其估计 K_m值）（图 4）。当使用非校正DNA聚合酶时，可通过降低dNTP浓度（ 0.01–0.05 mM）和成比例减少 Mg²⁺来提高保真度。

在一些应用中，dNTPs可能包含特殊核苷酸。例如，使用脱氧尿苷三磷酸（dUTP）替代dTTP，结合使用尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG）预处理，以防止残余PCR产物污染[2]。UDG是一种DNA修复酶，能够剪切含有尿嘧啶的DNA链。使用dUTP替代dTTP，会生成含有尿嘧啶的PCR产物。在开始PCR前，使用UDG孵育反应样品，能够去除含有尿嘧啶的污染性残余PCR产物，从而防止残余PCR产物引起假阳性结果（图 5）。

图 5.通过UDG处理，防止残余PCR扩增子污染。UDG切割DNA片段中的尿嘧啶碱基（红色线条）。经切割的DNA链在PCR条件下易于降解，因此不会在后续PCR中扩增。

在PCR中使用dUTP时，应注意如下事项。第一，dUTP取代可能会降低PCR效率和灵敏度。为克服这一问题，可采用最佳的dTTP和dUTP比例，使每个PCR产物分子携带足量的尿嘧啶碱基以有效完成UDG处理，而且不会明显影响PCR效率。第二，尽管 Taq DNA 聚合酶能够在DNA合成期间掺入dUTP，但 Pfu 等校正DNA聚合酶不能兼容dUTP，除非经过 特殊改造而可耐受尿嘧啶。这种特性主要是因为基于 Archaea的DNA聚合酶具有尿嘧啶结合口袋作为DNA修复机制[3,4]。

同样，氨基化dUTP、荧光素-12-dUTP、5-溴-dUTP和生物素-11-dUTP等改良型dNTP常被用于为后续实验加入标记物。与dUTP相似，DNA聚合酶必须能够引入经修饰的dNTP，以获得成功的PCR。

镁离子（Mg²⁺）作为DNA聚合酶活性的辅助因子，有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键（图 6）。此外， Mg²⁺ 能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷，从而促进引物与DNA模板形成复合物（图 8）[5]。

通常情况下，Mg²⁺ 以MgCl₂ 的形式提供。但是，因硫酸盐在某些情况下有助于确保更稳定和可重现的性能，诸如 Pfu DNA 聚合酶等一些聚合酶首选MgSO₄。由于镁离子能够与dNTP、引物、DNA模板和EDTA（如果存在）结合，因此，通常需要对镁离子浓度进行优化，以尽量提高PCR得率，并保持其扩增特异性。

在PCR中，标准的 Mg²⁺ 终浓度范围为1–4 mM，建议优化滴定增量为0.5 mM。 Mg²⁺ 浓度过低会降低聚合酶活性，导致PCR产物较少或无PCR产物。另一方面， Mg²⁺ 浓度过高则会提高引物-模板复合物的稳定性，产生非特异性PCR产物，并增加由dNTP错误插入导致的复制错误（图 7）。

PCR缓冲液能够为DNA聚合酶活性提供适宜的化学环境。缓冲液pH通常为8.0-9.5，一般使用Tris-HCl来调节。

对于 Taq DNA 聚合酶，缓冲液的一个常见成分是来自KCl的钾离子（K⁺)，其可促进引物的吸附。有时，也可使用硫酸铵(NH₄)₂SO₄ 代替KCl。铵离子(NH₄⁺) 具有去稳定作用，尤其对于错配引物-模板复合物碱基对之间的弱氢键，因此可增强反应特异性（图8）。

图 8.缓冲液离子对DNA双链形成的影响。钾离子和镁离子 (K⁺和 Mg²⁺) 能够与DNA骨架上的磷酸基团 (P^–) 结合并稳定双链形成，而铵离子 (NH₄⁺) 能够与碱基（N）之间的氢键相互作用并破坏双链形成。
 

由于 Mg²⁺ 与K⁺具有相似的稳定效应，因此，当使用KCl缓冲液时， MgCl₂ 的建议浓度通常较低(1.5 ± 0.25 mM) ，当使用(NH₄)₂SO₄ 缓冲液时，MgCl2的建议浓度通常较高 (2.0 ± 0.5 mM)。由于NH₄⁺ 与Mg²⁺具有拮抗效应，因此，在各种 Mg²⁺ 浓度下，含有(NH₄)₂SO₄ 的缓冲液都表现出更高的引物特异性（图9）。由于最佳的PCR缓冲液取决于所使用的DNA聚合酶类型 ，所以有必要遵循酶供应商的提供的缓冲液建议。

图 9.使用含不同 MgCl₂ 浓度的两种不同缓冲液获得的PCR结果，表明选择合适缓冲液对于PCR扩增特异性的重要性。在该反应中，使用 Taq DNA 聚合酶从人类gDNA扩增0.95 kb的片段。
 

在某些情况下，可在缓冲液中加入化学添加剂或辅助溶剂，通过减少错配来提高扩增特异性，并通过去除二级结构来提高扩增效率（表 2）。此外，一些DNA聚合酶 还随附提供了专为DNA聚合酶和PCR缓冲液优化的特殊增强剂。这些试剂常用于困难样品，如富含GC的模板。应注意，使用化学添加剂或辅助溶剂会影响引物退火、模板变性、 Mg²⁺ 结合以及酶活性。同时，它们还会干扰某些下游应用——例如，基因芯片实验中的非离子去污剂。因此，为了成功进行PCR扩增和下游实验应用，应慎重考虑缓冲液组成成分。

表 2.用作PCR增强剂的常见添加剂或辅助溶剂，以及其建议终浓度[6]。

1. Pelt-Verkuil EV, Belkum AV, Hays JP (2008) Principles and Technical Aspects of PCR Amplification.Dordrecht: Springer.
2. Longo MC, Berninger MS, Hartley JL (1990) Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions.Gene93(1):125–128.
3. Slupphaug G, Alseth I, Eftedal I et al.(1993) Low incorporation of dUMP by some thermostable DNA polymerases may limit their use in PCR amplifications.Anal Biochem211(1):164–169.
4. Lasken RS, Schuster DM, Rashtchian A (1996) Archaebacterial DNA polymerases tightly bind uracil-containing DNA.J Biol Chem271(30): 17692–17696.
5. Steitz TA (1998) A mechanism for all polymerases.Nature391(6664):231–232.
6. Bartlett JMS, Stirling D (2003) PCR Protocols.In: Methods in molecular biology(2nd ed).Totowa: Humana Press.