DNA聚合酶—关于PCR的四大关键属性

非特异性扩增是PCR反应最主要的障碍之一，因为它会显著降低目的基因扩增的产率和灵敏度，从而影响扩增结果的合理解释和下游实验应用的成功。而DNA聚合酶经常会延伸错配的目的基因和引物二聚体，这是非特异性扩增的常见来源。如何减少非特异性扩增？方案之一是在冰上配制PCR反应。这样有助于将DNA聚合酶的活性保持在低水平，但在PCR开始之前依然可能会合成不需要的产物。另一个办法是将DNA聚合酶的加入时间推迟到第一个循环的退火步骤。因为只有在90℃以上的初始变性步骤之后才能开始扩增，所以该技术被称为“热启动”。

尽管手动热启动程序能够有效改善特异性，但是其过程不仅费时费力，而且会增加样品污染和降低可重复性的风险。1994年，具有真正热启动特性的TaqDNA聚合酶问世[1,2]，通过在室温下配制反应时将特异性抗体与聚合酶结合来抑制其活性。在初始高温变性步骤（如，>90℃）阶段，结合的抗体失活，从而激活DNA聚合酶（图1）。
 

图 1.基于抗体的热启动DNA聚合酶及其在PCR反应体系中的激活提高了特异性。
 

此外，变性步骤还可能分离反应配制过程中形成的错配序列和引物二聚体，从而防止它们在后续退火和延伸过程中被DNA聚合酶扩增。这样，热启动DNA聚合酶便可降低非特异性扩增，提高产率，可实现室温下配制反应体系，方便用于高通量实验应用（图2-4）。
 

图 4.聚合酶活性对比：(A)真正的“热启动”DNA聚合酶和(B) “暖启动”DNA聚合酶。在60°C（恒温）下检测60分钟内的聚合酶活性。在热激活测试（蓝色曲线）中，在 94°C下对聚合酶加热处理2分钟，使抗体与聚合酶解离。不使用热激活（红色曲线）时，真正的热启动DNA聚合酶无法检测到聚合酶活性，而暖启动酶可在60°C被激活，因此不适用于热启动实验应用。
 

作为抗体的替代物，通过对酶活性位点进行热不稳定化学修饰，或者使用适配子等小分子缩短活化时间，也能够获得热启动性能。无论是否选择热启动技术，在非加热条件下有效阻断DNA聚合酶活性，对确保特异性而言都至关重要。（图4）
 

由于热循环是DNA扩增重复链式反应条件的关键特征，因此，所使用DNA聚合酶的热稳定性非常重要。尽管最初来自于嗜热菌菌株的 Taq DNA 聚合酶可耐受相对较高的温度，但是其半衰期在90°C以上时明显缩短。当使用 长时间高温 使具有二级结构和富含GC序列的DNA变性时，这一缺陷便成为一大难题。同样，在扩增长片段模板时，需要更大量的Taq DNA 聚合酶或补充Taq DNA聚合酶，以供长时间孵育。因此，从超嗜热菌分离的DNA聚合酶具有更高的热稳定性，将有助于克服这些挑战。

Pfu DNA聚合酶是一种为大家所熟知的超耐热酶，来自于水热环境中的超嗜热古细菌 Pyrococcus furiosus 。在95°C下，Pfu聚合酶的稳定性能比 Taq 聚合酶高20倍[3]。其它常见的超耐热DNA聚合酶包括来自古细菌 Thermococcus 和 Pyrococcus 的KOD和GBD等。

尽管古细菌DNA聚合酶的热稳定性极强，但它们在某些方面也具有一定局限性。例如，超耐热 Pfu DNA 聚合酶的合成能力较低（与 Taq DNA聚合酶相比），因此合成DNA的速度较慢。此外，古细菌DNA聚合酶无法扩增含有尿嘧啶的DNA模板，因为其存在尿嘧啶结合区域作为一种DNA修复机制[4,5]。含尿嘧啶的DNA序列是 防止PCR 残余污染 和经亚硫酸氢盐转化进行 基因座甲基化分析 的基础。
 

DNA聚合酶的校正能力决定了保真度，会影响DNA序列复制的准确性。因此，高保真DNA聚合酶就是具有强校正活性的酶。DNA聚合酶准确复制DNA序列（即获得无错误序列）的能力对分子克隆、测序和定点突变等实验应用至关重要（应用指南：定点突变）。

其校正活性基于其 3′ → 5′核酸外切酶活性，可校正错误插入的核苷酸。DNA聚合酶上的核酸外切酶活性位点与其5′→ 3′聚合酶活性位点是分离的（图5）。当错配的核苷酸插入聚合结构域，DNA合成将因不合适的碱基配对动力学而暂停。暂停期间，DNA聚合酶将切除错配的核苷酸并用正确的核苷酸替换[6]。

图 5.DNA聚合酶及其 5′→3′聚合酶结构域和3′→5′核酸外切酶结构域（基于 大肠杆菌 DNA聚合酶I的结构）。
 

DNA聚合酶的保真度检测方法多种多样，如菌落筛选测定、Sanger测序和下一代测序[7-10]。传统的菌落筛选方法，是将PCR扩增片段（ lac 基因的）克隆到质粒中。使用 蓝白斑筛选检测重组质粒转化的菌落。lac 基因插入片段上的突变（可能由于PCR过程中的错误复制产生）导致lacZ功能丧失，形成白色菌落。另一方面，无PCR错误的 lac 插入片段则形成蓝色菌落。使用Sanger测序对克隆的PCR片段进行测序，可检测DNA聚合酶的错误率。利用下一代测序，可直接对PCR扩增子进行测序（图 6）。
 

图 6.检测DNA聚合酶保真度的常用方法。
 

DNA聚合酶的保真度常用错误率的倒数表示（保真度=1/错误率），指发生错配的核苷酸数与聚合的总核苷酸数的比值。因此，DNA聚合酶保真度高度依赖于PCR扩增子长度和PCR扩增循环数。为了准确对比不同聚合酶的保真度，必须使用相同的方法和循环参数进行检测。

通常，保真度表示为与 Taq DNA 聚合酶保真度的相对值。天然存在的校正DNA聚合酶（如 Pfu 和KOD）的保真度约为 Taq聚合酶的10倍。但是，“下一代”高保真DNA聚合酶经过定向改造，具有超高的保真度， >约为 Taq 聚合酶的50-100倍（图7）。使用这些酶，错配率可低至几百万分之一。
 

图 7.利用下一代测序方法，对比常用的高保真酶。
 

酶的合成能力可定义为在一次结合中处理的核苷酸数量。DNA聚合酶的合成能力通常反应了合成率和合成速度，以及酶与底物的亲和力。合成能力高的DNA聚合酶适用于扩增长模板、具有二级结构和富含GC的序列，以及存在肝素、木聚糖和腐殖酸等PCR抑制剂的血液和植物组织样品（图8）。

图 8.具有高合成能力的DNA聚合酶能够有效扩增(A)来自人类gDNA的不同长度目标序列，(B)各种GC含量（无增强子）的模板以及(C)来自含有常见PCR抑制剂的样品的目的片段。这些实验使用了具有高合成能力的 Invitrogen™ Platinum™ SuperFi™ DNA 聚合酶 。
 

早期的高保真DNA聚合酶具有较强的核酸外切酶活性，所以合成能力较低，且会减慢聚合速度。因此，其扩增较长目标DNA的速度明显减慢。例如，校正 Pfu DNA聚合酶的保真度是 Taq DNA聚合酶的7倍，但其合成率还不到 Taq聚合酶的一半。使用另一个蛋白质的强DNA结合域对DNA聚合酶进行改造后，实现了合成能力的突破，同时不影响聚合酶活性（图9）[10]。这些改进型DNA聚合酶的合成能力提高了2-5倍。
 

图 9.DNA聚合酶的合成能力。(A)高合成能力的DNA聚合酶与其底物的亲和力更高，每次结合能引入更多核苷酸。(B)含有DNA结合域的DNA聚合酶序列示意图（Pol=聚合酶结构域， 3-′5′ exo = 3′→ 5′核酸外切酶结构域，DBD=DNA结合域，N=N末端，C=C末端）。
 

总之，DNA聚合酶的四大特点——特异性、热稳定性、保真度和合成能力——使这些酶具有多种功能，进一步拓展了它们在PCR中的应用。酶的 特异性 可确保获得高产率的目标PCR产物，同时尽量减少在克隆和定量等下游实验应用中的潜在问题。高 合成能力 和超耐热性 克服了扩增二级结构、富含GC的序列以及长DNA片段的困难。此外，提高 合成能力 使酶能够耐受DNA样品中天然存在的PCR抑制剂。最后，高 保真性 提高了序列复制的准确性。

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3. Pelt-Verkuil EV, Belkum AV, Hays JP (2008) Principles and Technical Aspects of PCR Amplification.Dordrecht: Springer.
4. Lasken RS, Schuster DM, Rashtchian A (1996) Archaebacterial DNA polymerases tightly bind uracil-containing DNA.J Biol Chem271(30): 17692–17696.
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9. Vandenbroucke 1, Van Marck H, Verhasselt P (2011) Minor variant detection in amplicons using 454 massive parallel pyrosequencing: experiences and considerations for successful applications.Biotechniques.51(3):167–177.
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