常见问题解答
UPAC 核苷酸代码 | 碱基 |
---|---|
A | 腺嘌呤 |
C | 胞嘧啶 |
G | 鸟嘌呤 |
T(或 U) | 胸腺嘧啶(或尿嘧啶) |
R | A 或 G |
是 | C 或 T |
S | G 或 C |
W | A 或 T |
K | G 或 T |
M | A 或 C |
B | C 或 G 或 T |
D | A 或 G 或 T |
H | A 或 C 或 T |
V | A 或 C 或 G |
否 | 任意碱基 |
答案取决于您项目的具体情况。通常,有利的是将文库的多样性保持尽可能低,仅靶向可能具有重要功能的基因/蛋白质区域。以下信息可以帮助您确定:晶体结构、保守基序、同系物的存在等。请随时与我们联系,我们将为您传授我们的丰富经验。
用于简并文库创建的常规方案(例如,易于出错的 PCR)包含许多不必要的突变。而且,DNA 改组等方法通常不能引起直接相邻突变的重组。另一方面,合成组合文库将突变限制在所需精确频率下的指定区域内。此外,邻近的突变将被重组(改组),与它们的接近程度无关。
使用三核苷酸诱变(TRIM)技术创造多样性可替换完整的密码子而不改变单个核苷酸。因此,您可以完全控制哪些氨基酸以给定的位置和比例出现,同时避免引入不必要的终止密码子。由于替换了完整密码子,TRIM 技术相比其他诱变技术产生的框外突变更少。
我们通常对最常见的表达宿主(人、CHO 和 大肠杆菌)使用优化密码子。也可根据要求提供其他密码子。有关详细信息,请联系我们。
理由如下:
- 因为您已经清楚某些氨基酸取代会干扰蛋白质功能(例如,互补决定区(CDR)中的半胱氨酸)
- 由于蛋白质可能出现的变体数是一个天文数字,甚至高出最高通量筛选能力的多个数量级。无用突变越少(例如发生在蛋白质次要区域的突变,或导致移码或终止密码子的突变),找到导致所需表型变体的机会越大
- 一些筛选测定需要大量成本和劳动力;因此,筛选较少的克隆可节省时间和金钱
- 组合文库(多达 1011 个变体)—多个密码子同时随机化处理,TRIM 技术可选
- 位点饱和诱变—单个密码子与每个可能的非野生型变体在不同位置进行随机化处理
- 受控随机化(多达 1011 个变体)—指定频率的无偏随机取代
- GeneArt Strings DNA 文库—线性 DNA 片段,最多可包含三个随机核苷酸区域
如果您需要具有特殊设计的简并库,请联系我们。我们兼顾每个项目,大多数情况下,都可以找到满足您需求的解决方案。
是。GeneArt 组合文库可以根据您的需要使用任意核苷酸混合物进行随机化处理,低至指定核苷酸的个位数百分比。
不需要任何材料。文库创建只需要序列文件(以电子版的方式提交)以及欲随机化位点的位置和性质信息。我们可以通过 在线订购系统为您的项目提供报价。您可在启动项目之前根据需要将有关文库要求的详细信息发送给我们的生产科学家。
是。我们可以将您的基因亚克隆到任意上市 Invitrogen 载体或您提供给我们的定制载体上。
有两个标准选项:
- 作为一组线性 DNA 片段,可用于限制酶的消化和亚克隆
- 亚克隆到任意载体中,并以甘油储备液和质粒制剂的形式交付
- 增加或调整启动子强度或特异性
- 增强或调节蛋白稳定性
- 修改或结合酶特性
- 增加受体、配体和抗体的结合亲和力
- 优化或更改信号肽效率
- 破坏蛋白质功能,同时保持免疫原性
- 组合并选择天然多态性
- 延长蛋白质半衰期
- 调节热稳定性
以下三个标准对于简并文库来说很重要,并且在所有 GeneArt 简并文库中均受质量控制(除 GeneArt Strings DNA 文库外):
- 非简并部分的最大序列完整性
- 含所需核苷酸分布的简并位置的最大序列变异
- 最大文库多样性
对于 GeneArt 诱变服务,我们需要您欲诱变的基因 DNA 或氨基酸序列,您计划使用的宿主生物(如果您选择将其包含在您的请求中,这对于基因优化来说很重要),5’/3’ 端所需的限制性位点和/或避免内部修饰,以及您是否想要任何其他添加的序列(例如,Kozak 序列、终止密码子等)。可通过 GeneArt 门户网站在线索求变体。对于各个文库,请访问您感兴趣文库类型的相应主页。在这些页面上,您可以下载并填写特定的调查表,并将信息发送至 geneartsupport@thermofisher.com。我们将为您回复报价和预期处理时间。
变体最多可包含以下四种修饰:
- 任何长度的 5’/3’端删除,且每侧添加额外 52 nt 的新序列
- 5’/3’端修饰,每侧最大 52 nt
- 5’/3’端延长,每侧最大 52 nt
- 不超过 40 nt 的内部修饰(最多允许有 3 个此类内部修饰区块)
- 任何长度的内部删除
各个修饰(无论是内部还是 5’/3’端)必须至少间隔 100 bp。
GeneArt Strings DNA 文库包含具有以下参数的克隆线性 DNA 片段:
- 长 200–2,000 bp
- 多达 3 个随机化区域,每个区域长达 30 bp
- 随机化区域可包含 IUPAC 指定的所有歧义核苷酸(N、K、S、B 等);U 为可选项
- 随机化区域距离片段两端至少应为 30 bp,彼此之间至少应为 30 bp
GeneArt Strings DNA 文库不适于使用 TRIM 技术或定制核苷酸混合物。如果您需要这种随机化类型,请咨询我们的其他文库产品。
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请将您的问题通过电子邮件发送至 geneartsupport@thermofisher.com,我们将亲自回答您的问题。
仅供科研使用,不可用于诊断目的。