PCR循環參數—成功的六個關鍵考量因素

圖1，PCR主要步驟圖示—變性、黏合降溫、延伸—由DNA模板擴增目標序列。
 

當PCR開始運行即啟動初始變性步驟，將雙股模板DNA分離成單股，以便引子能結合於目標區域並開始延伸。投入的DNA完全變性，有助於確保在第一個擴增循環週期內有效地對目標序列進行擴增。此外，這個步驟的高溫環境，有助於讓可能存在於樣品的不耐熱蛋白酶或核酸酶喪失活性，而高溫對熱穩定性DNA聚合酶的影響最小。當使用熱啟動DNA聚合酶時，此步驟也是為了該酶的激活，然而產品供應商可能會建議採取獨立的啟動步驟。

初始變性步驟通常會於94–98°C進行1–3分鐘。此步驟的時間與溫度，可能因模板DNA的性質和緩衝液鹽濃度而有差異。例如，根據DNA的複雜性和大小，哺乳動物的基因組DNA可能需要比質體和PCR產物更長的作用過程。同樣的，高GC含量（如>65%）的DNA往往需要更長的作用時間或更高的溫度進行變性（圖2）。一般來說，高鹽緩衝液（因應某些DNA聚合酶的需求）則需要更高的變性溫度（如98°C）來分離雙股DNA（圖3）。

一些DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶，長時間作用於95°C以上很容易變性。為了補償這種情形造成的活性下降，可以在初始變性步驟後添加更多的酶，或者在開始時添加高於建議用量的DNA聚合酶。源自於古生菌的高熱穩定性酶，能夠承受長時間的高溫，並在整個PCR過程中保持活性（了解更多關於DNA聚合酶特性的資訊）。

在初始變性步驟之後，後續的PCR循環開始於獨立的變性步驟，在94–98°C下持續作用0.5–2分鐘。與初始模板DNA變性步驟一樣，應根據模板DNA、DNA聚合酶和緩衝液成分的性質，對時間和溫度進行優化。例如，長片段和/或富含GC的目標DNA，可能在長作用時間和/或更高的溫度條件下的表現會更好（圖2、3）。添加劑如甘油（glycerol）、DMSO、甲醯胺（formamide）、和甜菜鹼（betaine）等的存在，可以加強變性步驟中雙股DNA的分離並提高特異性，從而克服了更長作用時間或更高溫度的需求（參見反應成分注意事項）。

在這個步驟中，降低反應溫度以允許引子與目標DNA結合。通常，0.5-2分鐘的作用時間足以讓引子進行降溫黏合。透過計算所選擇引子的解鏈溫度(T_m)，來確定PCR擴增的降溫黏合溫度。一般經驗來說，起始的降溫黏合溫度大約比引子的最低T_m再低3–5°C左右。

T_m的定義為當50%的引子及其互補序列表現為雙鏈體時的溫度，可透過多種方法計算。估計引子T_m的最簡單方法是運用DNA oligo中存在的核苷酸數量，使用公式如下：

T_m = 4 (G + C) + 2 (A + T)

由於反應中的鹽濃度(Na ⁺)會影響引子降溫黏合，因此使用以下公式以更準確地計算Tm：

T_m = 81.5 + 16.6(log[Na⁺]) + 0.41(%GC) – 675/primer length

利用寡核苷酸中，每個相鄰成對二核苷酸的熱力學穩定性，並結合引子與鹽濃度，也可以使用近鄰演算法的方式計算T_m [1,2]。這個方法也是我們線上工具的基礎，用於確定特定DNA聚合酶的引子建議黏合溫度。

計算T_m的一個重要考量因素是PCR添加劑、輔助溶劑和修飾核苷酸的使用。這些試劑的存在降低了引子–模板複合體的T_m。例如，10% DMSO可以使黏合溫度降低5.5–6.0°C [3]。同樣地，在PCR中使用7-deaza-dGTP取代dGTP也會降低T_m。在上述情況，黏合溫度應作相對應調整。

請注意，計算出的T_m值是作為引子降溫黏合的起始參考溫度。黏合溫度可能需要進一步優化，具體取決於擴增的結果。舉例來說，如果結果為無擴增或低擴增，則黏合溫度可在優化過程中以2–3°C的幅度降低。然而，如果出現非特異性PCR產物，黏合溫度則可以2–3°C的幅度升高（直至延伸溫度），以增強特異性（圖4）。

為了幫助將優化過程最小化並節省時間，數款DNA聚合酶的反應緩衝液設計含有等穩定成分（isostabilizing component）。這種特殊的配方提升了在降溫黏合步驟中引子–模板雙鏈體的穩定性，從而提高了PCR的產量並增強了特異性。此外，儘管使用引子的解鏈溫度不同，該緩衝液也能夠讓PCR引子–模板在一個通用溫度（如60°C）下進行降溫黏合。

對於黏合溫度的優化，溫度梯度熱循環模塊是很受歡迎的選擇，其透過整套模塊以設置最高溫和最低溫，因此可同時評估一系列孔盤或反應中的溫度變化。實際上，對孔盤進行精確溫度掌控以達真實梯度是十分困難的，推薦使用搭載獨立加熱/冷卻單元且"優於溫度梯度"的模塊，以實現PCR優化的精確溫度控管（圖5）。（了解更多：熱循環儀的注意事項）。

圖5，熱循環儀分別使用"優於梯度"與標準梯度技術，模塊溫度的比較。

在引子降溫黏合後，PCR的下一個步驟是延伸引子的3'端，與模板進行互補。在本步驟中，DNA聚合酶結合受質dNTPs後活化，由5'→3'合成延長新生鏈。將反應溫度提升到酶的最佳溫度以發揮其最大活性，對於熱穩定性DNA聚合酶而言，該溫度通常為70–75°C。 如果引子的黏合溫度在延伸溫度的3°C範圍以內，則可以將黏合和延伸溫度合併為一個步驟，稱為兩步法PCR，而不是傳統的三步法PCR。兩步法PCR縮短了PCR過程所需時間，因為不需要在黏合降溫和延伸之間切換及穩定溫度。

PCR的延伸時間取決於DNA聚合酶的合成速率和目標DNA的長度。Taq DNA聚合酶的典型延伸時間為1分鐘/kb，而Pfu DNA聚合酶的典型延伸時間為2分鐘/kb。因此，"慢速"酶將比"快速"酶需要更長的時間進行擴增，以獲得類似的產量（圖6）。同樣的，長DNA擴增子將比短DNA擴增子需要更長的延伸時間，來進行完整全長複製。除了在擴增長片段目標（如>10 kb）時增加延伸時間外，可能還需要降低PCR步驟的溫度，在延長的循環期間中，確保引子的結合與酶活性的維持。

變性、降溫黏合和延伸等PCR步驟將重複多次（或稱"循環"）以實現擴增目標DNA。循環次數通常為25-35次，但可能會因投入DNA用量和PCR產物的產量需求而有差異。如果投入的DNA少於10個copy，則可能需要高達40個循環週期才有足夠的產量。不建議超過45個循環，因為隨著循環週期數的增加，開始顯現非特異性條帶。此外，副產物的累積和反應組分的消耗會大幅降低PCR效率，導致PCR擴增曲線出現特徵性高原期（圖7）。相反的，應用於次世代定序中的無基因擴增（unbiased amplification）和對目標DNA的精準複製（如cloning）時，低循環週期是更適合的方式。

最終的延伸步驟在最後一個PCR循環完成後進行。在此步驟中，PCR混合物在延伸溫度（通常為72°C）中作用最後的5-15分鐘。最終步驟的持續時間也取決於擴增子的長度和組成，應進行優化以確保目標DNA全長聚合和優良的產量（圖8）。除了填補不完整的末端外，具有末端脫氧核苷酸轉移酶活性(terminal deoxynucleotide transferase，TdT)的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶），在此步驟中會於PCR產物的3'末端添加額外的核苷酸。因此，如果要將PCR擴增子cloned入TA載體中，建議最終延伸步驟為30分鐘，以確保正確的3'-dA 尾部和有效的PCR cloning（了解更多關於TA cloning的資訊）。

1. Breslauer K, Frank R, Blöcker H et al. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A 83(11):3746–37450.
2. Rychlik W1, Spencer WJ, Rhoads RE (1990) Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Res 18(21):6409–6412.
3. Chester N, Marshak DR (1993) Dimethyl sulfoxide-mediated primer Tm reduction: a method for analyzing the role of renaturation temperature in the polymerase chain reaction. Anal Biochem 209(2):284–290.