氯化锂(LiCl)沉淀法纯化RNA

利用氯化锂（LiCl）沉淀纯化RNA

氯化锂（LiCl）常用于沉淀RNA，乙醇和单价阳离子 (如钠或铵离子) 沉淀则使用更普遍。氯化锂（LiCl）沉淀法较其他RNA沉淀方法具有较大的优势，其沉淀DNA、蛋白质或碳水化合物的效率更高 (Barlow et al., 1963)。 采用该方法可以去除RNA沉淀中的翻译或cDNA合成抑制剂 (Cathala et al., 1983).。 它还提供了一种简单快速地回收体外转录反应中的RNA的方法。

Invitrogen在其MEGAscript和mMESSAGE mMACHINE大规模体外转录试剂盒中采用氯化锂（LiCl）作为RNA回收试剂。 但我们通过提供电话技术服务，发现许多用户不愿意使用氯化锂（LiCl），很可能是由于没有描述其特性的文献数据。 我们对氯化锂（LiCl）的使用进行了系统性研究，发现它是一种极为高效的RNA沉淀方法，特别是从体外转录反应中沉淀RNA。

我们研究的三个主要变量是： (a) 沉淀形成的温度 (b) RNA和氯化锂的浓度 (c) 收集沉淀RNA的离心时间和速度。 下面探讨了上述所有变量。 我们发现采用氯化锂(LiCl)沉淀的RNA样本，无需进一步纯化，即可用于杂交和体外翻译反应。 据报道，由于氯离子的抑制作用，氯化锂不适用于无细胞翻译 (Maniatis, et al., 1989)；但我们尚不能确定其在翻译或显微注射实验中存在任何有害作用。 其他优点在于锂沉淀可以有效去除未结合的NTP，从而提高了紫外分光光度计定量的准确性。

采用恒定浓度的2.5 M LiCl沉淀RNA，不断减少各种大小的RNA的量，测定特定大小和浓度的RNA是否有沉淀阈值。 将三种非放射RNA与示踪剂标记的RNA (5 x 104 cpm) 混合，分装于试管内。 先后加入水和氯化锂至终体积50 µl，氯化锂的恒定浓度为2.5 M。 分别检测各种大小的转录本，观察大小对沉淀效率的影响。 将所有样本置于-20°C下冷却30分钟，随后在4°C下以16,000 x g离心15分钟。 吸出去除上清液并干燥10分钟。 将沉淀重悬于10 µl的凝胶上样缓冲液中 (80%甲酰胺、0.1%溴酚蓝、0.1%二甲苯蓝和1 mM EDTA)，95°C下加热5分钟。 取每种样本各一部分，在4% PAGE-尿素凝胶上电泳。 干燥凝胶并直接进行胶片曝光30分钟。 图1显示了RNA浓度对采用氯化锂沉淀100碱基转录物的影响。 结果显示氯化锂可有效沉淀稀释至5 µg/ml的100个核苷酸的RNA。 这个结果出人意料，因为一般认为只有高浓度的RNA方可采用氯化锂沉淀。

采用三种不同大小的转录物检测氯化锂浓度对沉淀效率的影响。 各种大小的转录物保持恒定浓度1 µg/ml，氯化锂的检测浓度为2.5、1.0和0.5摩尔。 此外，加入标记的RNA (5 x 104 cpm) 作为示踪剂。 样本置于4°C下离心10分钟后吸干。 将沉淀重悬于10 µl的凝胶上样缓冲液中，95°C下加热10分钟，取每种样本各一部分在4% PAGE-尿素凝胶上电泳。 干燥凝胶并曝光30分钟 (不采用增光屏)。 图2显示了氯化锂对300碱基转录物沉淀的影响。 结果显示0.5摩尔浓度的氯化锂可有效沉淀RNA，所有浓度氯化锂的回收率相当。 泳道5为无氯化锂对照，用于分析离心的影响。

图2. 氯化锂浓度对RNA沉淀的影响。 泳道1：RNA分子量标准。 泳道2：2.5 M LiCl。 泳道3：1.0 M LiCl。 泳道4：0.5 M LiCl；泳道5：无LiCl。

RNA保持1 µg/ml的恒定浓度，氯化锂浓度为1.0 M。 检测的沉淀时间为0、0.5和1.0小时。 0.5和1.0小时的时间点采用-20°C和25°C孵育，分别检测沉淀时间和温度。 按前述方法制备样本，并在4% PAGE-尿素凝胶上显示。 图3显示，沉淀时间为30分钟时的沉淀效率高于立即离心；如泳道2与泳道3所示。 尽管-20°C和25°C下沉淀30或60分钟无差别 (如泳道3-6所示)，但我们建议可以在-20°C下沉淀30分钟，降低可能存在的RNA酶的活性。

图3. 氯化锂沉淀温度的影响。 泳道1：RNA分子量标准。 泳道2：不冷却立即离心的RNA。 泳道3：离心前置于-20°C下冷却30分钟的RNA。 泳道4：采用25°C下孵育30分钟的RNA检测沉淀时间。 泳道5：20°C下冷却1小时的RNA。 泳道6：25°C下孵育1小时的RNA。

样本中RNA恒定浓度为1 µg/ml，体积为50 µl，氯化锂浓度为1.0 M，4°C下以16,000 x g离心0.5、1、2、5、10和20分钟。 分别检测含有放射性RNA的不同大小的转录物。 图4显示离心时间是影响RNA回收的主要因素。 4°C下以16,000 x g离心20分钟，定量回收50 ng的RNA。 泳道2-7显示离心时间越短，回收率越低。

图4. 离心时间对RNA沉淀的影响。 泳道1：RNA分子量标准。 泳道2：离心20分钟的RNA；泳道3：10分钟；泳道4：5分钟；泳道5：2分钟；泳道6：1分钟；泳道7：30秒。

采用氯化锂沉淀法纯化RNA是一种快速方便地从体外转录翻译中提取转录物的方法，其未结合的核苷酸残留量极低。 氯化锂的一个主要优点是它不会有效地沉淀蛋白质或DNA。 在某些应用领域 (如核糖核酸酶保护分析)，无需凝胶沉淀。 在体外或体内翻译中，采用氯化锂方法优于乙醇沉淀法，因为氯化锂通常优先回收全长转录物。 此外，由于氯化锂可以有效去除游离核苷酸，因此采用此方法沉淀的RNA进行紫外分光光度法定量时，可以获得更准确的数据。 类似的方法是采用异丙醇替代乙醇进行核酸沉淀。 异丙醇的核苷酸沉淀效率低于乙醇，当采用紫外分光光度法定量RNA浓度时，可以获得更准确的数值。

与此前公布的报道不同，我们发现氯化锂不会优先沉淀更高分子量的RNA。 采用长度为100、200、300、400和500碱基的同等量的RNA混合物 (RNA Century™分子量标准) 进行氯化锂沉淀，显示所有大小的RNA的沉淀效果均很好 (数据未显示)。 一般认为大分子量转录物有助于小分子量转录物的沉淀，本文的实验分别采用了各种大小的转录物。 单个大小的RNA (如100碱基) 与各种大小的RNA分子量标准的混合物沉淀未见差异。 但值得注意的是，氯化锂无法有效沉淀一些小RNA (如tRNA)。 这可能是由于tRNA高度复杂的二级结构造成的。 我们推荐使用氯化锂沉淀含有至少400 µg/ml RNA的溶液中的RNA，我们尚未检测其在更宽的RNA范围中的使用，因此不推荐将其用于较低浓度的RNA。

• Barlow, J.J., Mathias, A.P., Williamson, R., and Gammack, D.B., (1963). 适用于未降解的高分子量核糖核酸的一种简单的定量提取方法。 Biochem. Biophys. Res. Commun. 13:61-66.
• Cathala, G., Savouret, J., Mendez, B., West, B.L., Karin, M., Martial, J.A., and Baxter, J.D., (1983). 一种提取完整且具有翻译活性的核糖核酸的方法。 DNA 2:329-335.
• Maniatis, Sambrook, Fritsch, (1989). 分子克隆： 实验室手册第2版，第3卷，附录E.12。