通过限制性酶切和连接的克隆是一种将双链 DNA 片段从一个质粒转移至另一质粒的简单、便捷方法。
首先：
- 选择限制性内切酶，其识别序列位于您感兴趣基因的侧翼
- 按照推荐时长对反应进行孵育
- 纯化相应片段
- 将片段连接至您感兴趣的质粒
Invitrogen Anza 限制性内切酶克隆系统
包含限制性内切酶和 DNA 修饰酶的完整系统——极致简约，完美克隆。
- 所有限制酶使用统一的缓冲液
- 对于所有类型的DNA均使用同一种酶切方案
- 15 分钟内即可酶切完全
- 即使过夜酶切也不会出现星号活性
Anza 缓冲液
常规限制性内切酶
限制性内切酶 (RE) 可以切割双链 DNA中特定的 4-8 个碱基对的反向重复识别序列。DNA 酶切后的产物为平末端或包含 5′或 3′突出端。
DNA 修饰酶
连接酶
不管限制性内切酶切形成的末端类型如何，切割得到的 DNA 片段末端均含有 3´ 羟基和 5´ 磷酸基。在依赖 ATP 的反应中，DNA 连接酶可以共价地连接双链 DNA（或 RNA）的 5’ 磷酸基和 3’ 羟基。
碱性磷酸酶
末端修复
多聚核苷酸激酶
多聚核苷酸激酶用于 DNA 和寡核苷酸的 5′ 磷酸化。在克隆制备的 DNA 连接阶段，无论是 DNA 插入片段还是载体 DNA 均应包含一个 5′ 磷酸基。通常使用T4 PNK 处理 PCR 扩增后的 DNA，以便将 5’端磷酸化进行后续克隆连接。
DNA 平端化
DNA 平端化试剂盒可把 DNA 的粘性末端转换为平端，用于平端连接反应。当载体不包含可生成平末端的识别位点时，这个方法就很有用。
聚合酶
聚合酶用于产生平末端 DNA或整合标记 的DNA。