通过流式细胞术进行稀有细胞分析——检测稀有事件的分步策略

要使用流式细胞术在研究环境中进行稀有事件分析，应考虑生物材料的数量、要获取的事件数量以及识别相关群体的标记。此外，“下一代”仪器，如 Invitrogen Attune NxT，能够达到高速采集和高灵敏度的特点，可以轻松检测稀有细胞，并对稀有细胞进行表型和功能表征。

使用这些链接浏览本指南，以了解有关流式细胞术分析稀有细胞的三个阶段（分析前阶段、分析阶段和数据分析）的更多信息。

本页内容：

• 分析前阶段
• 分析阶段
• 数据分析
• 评论
• 参考文献

分析前阶段涉及根据稀有群体的预期频率和需要获得的事件数量来决定应使用哪种生物基质来识别稀有细胞。图 1 描述了 泊松统计如何定义多个事件将在固定的时间/空间/体积间隔内发生的概率 [4]。

良好的实验实践建议将 CV 保持在 5% 以下，因此应定义要获取的事件数，以保持尽可能低的 CV [6]。例如，要识别代表 0.01% 的细胞群，应获取 500 万个事件。

表 1.为了检测到 0.01% 的总体，获得低于 5% 的 CV 所需的事件数。使用稀有事件计算器工具。

有时，由于缺乏血液或不同的实验背景，事件的最终数量不足以满足泊松统计给出的数字标准。在这种情况下，“阳性”可以在将实验样本与一组对照样本（包括足够的阴性对照）进行比较后确定，使用标准统计工具比较频率 [7]。因此，最大化信噪比对于区分相关群体的信号和背景信号至关重要。此外，鉴于采集大量事件至关重要，样品浓度和流速是关键参数，应进行调整以缩短采集时间并避免同时发生的增加（参见 BioProbes 第 71 条：使用流式细胞术检测稀有事件的工具和策略）。同时发生的事件是不确定的，不具有有价值的信息。此外，同时发生将“受污染”事件引入实验。即使在具有高度、面积和宽度组合的双变量图中，单峰上的门移除了双峰，不幸的是，没有方法可以完全移除它们。

因此，为了尽可能地保持数据完整性，最好将同时发生的事件保持在最低限度。此外，它会影响绝对计数，因为包含两个或多个粒子的事件仅计为一个粒子。为了理解重合度是如何计算的，需要澄清一些定义仪器性能的定义：

1. 最大事件率是仪器在立即开始计数两个细胞之前每秒可以记录的事件数；
2. 流速定义了样品流过机器的速度；和
3. 样品浓度是给定体积中的细胞数。

有两种方法可以计算流式细胞仪的最大事件率。一种标准的、更准确的方法是将最大事件率定义为所有事件中有 10% 是同时发生的分析率（根据泊松统计）。这是 Attune NxT 流式细胞仪的设计方法。另一种方法是引用电子数据采集系统的最大事件率。使用这种方法设计的系统与巧合无关，因此在仪器指定的最大事件率下会产生非常高的重合率。

鉴于此信息，可以预期使用 10% 符合方法设计的仪器具有指定的最大事件率为 30,000 个事件/秒。预期事件率低于理论事件率，因为同时发生的事件仅计为单个事件。在 30,000 个事件/秒时，事件率有 10% 的差异（按设计）。应该注意的是，符合率随着分析率的增加而增加。慢流分析仪的中止率通常会更高，但是这些高中止率与分析仪无关，因为分析的是群体的频率而不是群体的绝对产量（如细胞分选仪）。因此，超过 35,000 个事件/秒的 10% 速率可能是合理的，但是，超过 10,000 个事件/秒的 10% 中止率可能不是合理的。

一旦确定了需要获取的事件数量和实验目的，就需要考虑生物材料的数量。因此，应根据需要分析多少事件来决定所需的血液量。为了进行深入的稀有事件分析，例如需要分析恒定自然杀伤 T (iNKT) 细胞或抗原特异性 T 细胞的表型和功能，应从患者体内至少抽取 30 mL 血液。

此外，在此步骤中，需要根据细胞识别所需的标记做出决定，并且应根据面板设计中的最佳实践来设计多色面板 [8]。特别是，应该为生存力标记和/或 DUMP 通道保留一个通道（第 14 页的“注释”）。

根据实验终点，可能会或不会根据实验终点富集相关稀有种群。富集可以通过使用 Ficoll-Plaque 分离获得 PBMC 或通过血沉棕黄层分离外周血细胞来进行。此外，通过磁性细胞分离对靶细胞进行定量预富集，可快速处理大样本（10⁶ 至 10⁹ 个细胞），是增加稀有抗原特异性 T 细胞、iNKT 细胞或循环内皮细胞频率相对数量的绝佳方法[9]。可以通过表征稀有细胞群的已知标记物，或通过使用四聚体，或通过对分泌细胞因子的细胞进行特异性富集来进行富集 [10-13]。

使用抗 CD154 mAb 可以预富集稀有抗原特异性 CD4 T 细胞。通过在刺激过程中加入荧光偶联的 CD154 特异性抗体，该测定与细胞内细胞因子染色完全相容，可用于长达 24 小时的刺激。最后，另一种分子可用于富集活化的 CD4+、CD8+ 或 CD1d+ T 细胞，即 CD137 (4-1BB)，它是 TNFR 超家族的成员，已被证明在 16-24 小时的刺激后表达 [6]。短期（6 小时）刺激后对 CD137 和 CD154 的组合分析可能最适合同时检测对相同抗原起反应的常规 T 细胞和调节性 T 细胞 (Tregs) [14]。

如果稀有细胞丢失，富集可能会产生负面影响，但目标当然是去除不需要的细胞，同时保留相关稀有细胞。[15]。促进稀有细胞检测的另一种策略是通过体外扩增方法增加抗原特异性 T 细胞的数量，即使单个 T 细胞的扩增不仅受其功能状态（例如幼稚、记忆、无反应的），但也有其他反应性或辅助细胞的存在。因此，很难从长时间体外培养后获得的频率中获得原始样品中给定细胞群的频率。同样，扩增细胞的表型和功能可能会因培养条件而显着改变 [16, 17]（表 2）。

表 2.用于检测稀有抗原特异性 T 细胞的富集方法。该表代表了以两种不同方式富集抗原特异性 T 细胞的不同方法。直接方式，通过 MHC 多聚体（顶部）或通过细胞因子分泌测定的间接方式，CD154 或/和 CD137 富集（底部）。

方案 1。流式细胞术检测 iNKT 细胞

iNKT 细胞是由恒定 Vα24Jα18 TCR 表达唯一识别的固有免疫样淋巴细胞，它们将 CD1d 呈递的自身和外源脂质识别为同源抗原。 iNKT 细胞的特点是表达典型的 T 淋巴细胞标志物（CD3、CD4、CD8）和 NK 标志物（CD161、CD56），它们占人类 T 细胞的 0.1-0.001% [18]。根据 CD4 和 CD8 表达，成熟的 iNKT 细胞可分为功能不同的亚群，即 CD4+CD8-、CD4-CD8- 和 CD4-CD8+ [19] [20]。

准备用于识别 PBMC 中 iNKT 和粘膜相关不变 T (MAIT) 细胞的细胞

1. 在抗凝剂（EDTA 或肝素）中采集至少 30 ml 的血液，并在 4 小时内按照标准程序进行外周血单个核细胞 (PBMC) 的分离。
   警告：使用新鲜采集的血液。由于受体脱落、受体下调或细胞死亡，前一天采集的血液可能会产生微不足道的结果。
2. 用 DPBS 1:1 稀释血液，并在 50 mL 锥形管中将 35 mL 的稀释细胞悬浮液小心地分层到 15 mL 的 Ficoll-Paque 上。
   警告：非常缓慢地执行此步骤，以免破坏 Ficoll 表面。
3. 在 20°C 下，在不带制动器的旋翼式转子中以 400×g 离心 30 分钟。
4. 吸出上层，使单核细胞层（淋巴细胞、单核细胞和血小板）在间期不受干扰。
5. 小心地将单核细胞层转移到新的 50 mL 锥形管中。
6. 用 DPBS 填充锥形管，混合并在 20°C 下以 300×g 离心 5 分钟。小心地完全去除上清液。
   警告：在此步骤中，可能会形成一些堵塞物。为避免堵塞，将 0.5% 的牛血清白蛋白 (BSA) 或胎牛血清 (FBS) 添加到 DPBS 并过滤收集的 PBMC。
7. 重复步骤 6。
8. 使用 Turk 或 Trypan Blue 计数细胞。

用识别 iNKT 细胞的 mAb 染色

9. 为每个单染色对照准备试管、用于 FMO 对照的试管和含有识别相关细胞所需的所有单克隆抗体 (mAbs) 的试管。
10. 在所有试管中放入相同数量的细胞 - 每个试管中至少有 500 万个细胞。
    警告：用移液管悬浮孔中的细胞，必要时过滤。
11. 用 DPBS+0.5% FBS 清洗细胞。在 20°C 下以 300×g 离心 5 分钟并弃去上清液。
12. 将不同的 mAbs 放入试管中（6B11、TCR 7.2、CD3、CD4、CD8、CD161）-根据步骤 8 在先前滴定的浓度下选择荧光染料。涡旋试管，在暗处 20°C 下孵育 20 分钟。
13. 用 DPBS+0.5% FBS 清洗细胞。在 20°C 下以 300×g 离心 5 分钟并弃去上清液。
14. 重悬细胞以达到 4-10*106 个细胞/mL 的浓度并立即获取细胞。

CEC 是响应内皮损伤而从内膜单层分离的成熟内皮细胞 [21]。内皮功能障碍可能发生在不同心血管疾病的发展和进展过程中。发现这些细胞的一个大问题是尚未确定识别循环内皮细胞及其祖细胞的独特标记或标记组合。目前，用于此目的的最常用标记是：DNA、CD34、CD45、CD133、CD31、CD146 和 CD309。具体而言，循环内皮细胞被定义为 DNA+、CD34+、CD45-、CD31+、CD133-、CD309+ 的事件。内皮祖细胞 (EPC) 定义为 DNA+、CD34+、CD45dim、CD31+、CD133+、CD309+/- [22-24]。

方案 2。外周血细胞中循环内皮细胞的识别

1. 在抗凝剂（EDTA 或肝素）中采集 30 ml 血液，并在 4 小时内按照标准程序进行外周血细胞（血沉棕黄层）的分离。
2. 在旋翼式转子中，在 20°C 下以 200×g 离心 20 分钟。
3. 吸出上层（血浆），使外周细胞层（淋巴细胞、单核细胞和血小板）在间期不受干扰。
4. 小心地将外围细胞层转移到新的 50 mL 锥形管中。
   警告：这应该非常缓慢地使用小容量移液器进行，以便获得大部分细胞并避免收集过多的红细胞。
5. 用红细胞裂解液填充锥形管，混合并孵育 30 分钟。
6. 在 20°C 下以 300×g 离心 5 分钟。小心地完全去除上清液并重复。
7. 使用 Turk 或 Trypan Blue 计数细胞

用 mAb 对细胞进行染色，以识别 CEC 和 EPC 细胞

8. 为每个单染色对照准备试管、用于 FMO 对照的试管和包含所有单克隆抗体 (mAb) 的试管。
9. 在所有试管中放置至少 500 万个细胞。
10. 用 DPBS+0.5% FBS 清洗细胞。在 20°C 下以 300×g 离心 5 分钟并弃去上清液。
11. 将不同的滴定 mAb 放入试管中（至少使用：CD45、CD34、SYTO16、CD133）。涡旋试管，并在暗处 20°C 下孵育 20 分钟。
12. 用 DPBS+0.5% FBS 清洗细胞。在 20°C 下以 300×g 离心 5 分钟并弃去上清液。
13. 重悬细胞以达到 4-10*106 个细胞/mL 的浓度并立即获取细胞。

设置流式细胞仪

14. 选择分析所需的所有通道并关闭所有其他通道以节省计算机内存。
15. 设置分析所需的所有点图和直方图并检查荧光溢出。
16. 通过使用单染色对照并创建补偿矩阵，为每个通道设置所有 PMT。
17. 获取单染色对照和 FMO 管，并检查门和门控策略。
18. 获取所有染色管并进行分析。用于分析 iNKT 和 MAIT 细胞表型的门控策略如图 3 所示，而用于分析 CEC 和 EPC 的门控策略如图 4 所示。

即使在采集过程中关闭了未使用的参数，由于采集的事件和参数的数量，数据文件往往很大。因此，数据分析得益于强大而快速的硬件（至少 8gb RAM 和至少 500gb HHD）。可以使用相同的采集软件或在采集后使用 FlowJo 或 FSC Express 进行数据补偿和数据分析。然而，鉴于流式细胞术的高通量特性以及基于立即获取数百万个事件测量更多参数的能力，不再可能使用经典的手动分析技术来分析数据。因此，一套能够以更自动化和更公正的方式分析、可视化和解释大量细胞数据的工具被包含在计算流式细胞术中 [25, 26]。

有几个软件程序（基于主成分分析，PCA）使用可视化技术作为传统二维点图的替代方案。第一篇关于使用 PCA 分析流式细胞术数据的论文发表于 2007 年；这种方法应用于对不同年龄（年轻、中年和百岁老人）供体的原始和记忆 T 细胞室进行八色细胞荧光分析 [27]。如今，在大多数常用和使用的数据分析平台上都可以使用 SPADE、FlowMap、FlowSOM、viSNE、PhenoGraph、Scaffold map 和 DREMI-DREVI 等多种工具。这些方法主要是降维或基于聚类的技术[在 [26] 中进行了评论]。应用于 CEC 检测的 t-SNE 分析示例如图 5 所示。在识别非常稀有的细胞类型时可能存在一些问题，因为它们可能被许多聚类算法误认为是噪声。要识别所有相关群体，可能需要进行详尽的门控，从而导致强烈的过度聚类，然后仅选择与表型相关的那些特征。使用传统的聚类算法，建议确保仅使用相关标记进行聚类。差异很小或指示与细胞类型识别无关的特性的标记（例如，激活标记）最好被排除在外，因为这些只会对相似性计算产生噪音[26]。

最大化信噪比是区分相关群体的信号与背景的根本。确定碎片的阈值可能会有所帮助，同时使用门控策略从分析中去除死细胞并排除双峰/聚集体/碎片（由活力标记物，例如胺活性染料识别），同时还使用“DUMP” ”通道包含识别无关的细胞上的抗原的抗体。此外，应监控参数“采集时间”，以消除采集过程中由堵塞或其他可能的瞬态问题引起的事件突发（图 6）。

值得注意的是，为了优化测定的灵敏度，需要考虑的另外两个因素是仪器的清洁度和样品的完整性。确保使用的仪器和液体清洁且不含可能对稀有群体造成错误影响的颗粒，这一点很重要。

从全血中获取PBMC以及从血沉棕黄层开始获取外周血细胞需要一个半小时。用 mAb 染色需要 20 分钟，然后洗涤 5 分钟。因此，考虑到需要染色的试管数量以及所需的洗涤次数，从血液到准备采集的细胞所需的时间可能约为两个半小时。采集时间取决于仪器、采集速率和体积，以及不同样品之间的残留（两个样品之间可能需要不同的洗涤）。

由于采集大量事件以检测稀有细胞群至关重要，因此样品中的浓度和流速是关键参数，通常可以缩短采集时间 - Attune NxT 能够以高达35,000 个事件/秒。例如，要测量占样本 1% 且样本浓度范围为 400 万的具有 1% CV 的细胞类型（即嗜碱性粒细胞），Attune NxT 只需 33 秒即可采集样本；要测量占样本 0.1% 的 1% CV 的细胞类型（即 NKT 细胞、iNKT 细胞 & 树突状细胞、循环内皮细胞）并且样本浓度范围约为 400 万，Attune NxT 只需 4 分钟 – 比流体动力流式细胞仪快 10 倍；获得 10 个 iNKT 事件所需的时间在 14 到 3 分钟之间变化。这意味着可以在同一天分析多个样品，从而节省大量时间、人力和相关成本。

我们衷心感谢意大利摩德纳大学和雷焦艾米利亚医学院的 Sara De Biasi 和 Andrea Cossarizza 为本指南做出的宝贵贡献。

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