什么是全光谱流式细胞术基础理论？

全光谱流式细胞术是基于传统流式的基础发展而来，又拥有独特的光学检测和分析能力。传统流式光学系统是检测发射出的光子，这些光子经过很多镜像和滤光片然后到各自的光电倍增管（PMT）中。滤光片有着对应波长范围，可以区分不同窄宽的光谱，从而鉴定出单个荧光染料在单个检测通道上的光谱信息（图 1）。In biological applications this is critical for associating a particular fluorescence signal with a label or phenotype.但是在光谱流式上，荧光染料的发射光谱是由一组波长范围内的检测器（检测通道）得到的（图 1）， 这样每个荧光染料的荧光光谱可以识别出来，记录光谱特征，然后在多色流式实验中上样使用。Spectral unmixing can then be performed, which relies on the discrimination of fluorescence by identifying differences in the overall spectral signatures.

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全光谱流式细胞术简介

当单个细胞甚至悬液中的颗粒流过全光谱流式细胞分析仪中的单个或多个激光器时，流式细胞术可以实现对细胞和颗粒快速地鉴定并分析表征。流式细胞仪的检测器可以检测到每个细胞或颗粒的散射光信息和多个荧光信号，最终分析细胞或颗粒上的信息。全光谱流式细胞术就这样可以同时对单个样本中的数百万个细胞进行精准检测，成为当下热门的实验技术！使用全光谱流式细胞术，完成单细胞分析，可以探索出细胞的异质性和单细胞动态变化，其细胞鉴定和表征分析广泛应用于科学研究、生物技术、生物制药和临床应用中。全光谱流式细胞术的常见应用包括免疫学、传染病、肿瘤免疫学、微生物学、生物标志物鉴定和药物发现以及分子生物学。人们越来越想要了解探索复杂的免疫系统，并且利用免疫细胞来提高健康状况，这都使高维细胞检测越来越普及，赛默飞的前沿流式仪器和荧光染料也助力全光谱流式细胞术有了在单个样本中更高的多参数分析能力。


全光谱流式细胞术发展历程

自20世纪70年代初期第一台单个荧光参数检测的商用流式细胞仪推出后，流式细胞术已经发展了数十年 [1]。到20世纪70年代后期，两激光的流式仪器功能升级，不仅可以细胞检测和计数，而且还可以进行细胞分选 [2]。流式分析技术不断发展，有了越来越多的激光器和检测器，从而可以检测更多的参数 [3–5]。近年来，五激光流式细胞仪可以检测到28 个荧光参数 [6]。

尽管流式细胞仪的检测能力有了实质性提升，但人们兴致高昂地期望可以检测整个荧光光谱，因此努力地开发出类似于荧光分光光度计的光谱流式细胞仪。在这里，主要困难是检测单个细胞时荧光信号收集时间非常的短。感谢光学配置和检测器件的研发成果使得光谱流式细胞仪在微秒内取得完整光谱的检测 [7]。

2004 年普渡大学 Robinson 课题组首次发表了流式细胞术的光谱技术方法 [8–10]，Sony Biotechnology 于 2012 年推出了第一台商用光谱流式细胞仪，使用棱镜和光电倍增管 (Photomultiplier tubes, PMT) 来收集和放大光学信息。Cytek Biosciences、BD Biosciences 和赛默飞世尔科技等多家公司也开发出了使用不同信号检测和放大系统的光谱流式细胞仪和光谱细胞分选仪。

流式分类文章集

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当下有了光谱流式仪器和荧光染料，科学家们能够探索更多蛋白靶标。即刻阅读光谱流式文献，引领科学研究发展。

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光谱流式细胞术的优缺点

从单个样本中研究更多细胞特性的需求推动了流式细胞术领域在以前未使用的光谱区域实施更多的激光器和检测器。[9-11] 为了实现这一目标，仪器和软件的进步已经成功地将快速单细胞分析与高灵敏度光检测技术相结合，扩展了基于荧光的应用。此外，紫外、近紫外和近红外区域的新荧光试剂继续支持多参数流式细胞术功能。更多的激光和光电探测器可使用更多的抗体和试剂，然而，这增加了实验设计和分析的复杂性。

光谱流式细胞术的创新有助于克服一些限制可检测参数数量的障碍。当前的光谱流式细胞术仪器提供许多与传统流式细胞术相同的功能，包括单细胞分析、小颗粒检测和多参数检测，但具有一些额外的优势，包括提高试剂选择的灵活性和去除自发荧光。 [2– 8, 12–15] 光谱流式细胞术无疑扩展了研究人员在实验中同时研究大量参数的能力。

通过大学研发以及最近通过商业渠道进行的光谱流式细胞术创新仍有改进的潜力。当配对荧光读数或荧光染料以满足实验和仪器硬件组件的需求时，高参数实验可能存在局限性。通过利用光谱学相关领域中存在的高级数学分离模型来利用分析能力，可以实现改进。在许多方面，光谱流式细胞术领域还处于起步阶段，但这是一个仍在发展和人们津津乐道讨论的话题。浏览以下主题，了解常规和光谱流式细胞术硬件、检测和分析之间的一些异同。

 传统流式细胞仪全光谱流式细胞分析仪
荧光染料的检测波长范围接近发射波长最大值~350–900 nm
检测器(荧光染料)数量一个多个
修正荧光溢出方法补偿调节光谱解析
选择荧光染料考虑光学配置考虑荧光染料的光谱特征是否唯一
去除自发荧光否是

表 1. 传统流式和全光谱流式的主要特征比较。
 

了解更多：流式细胞术基础知识

区分全光谱和传统流式细胞术：

  • 由光电检测器收到的发射光带宽
  • 检测每个荧光染料的检测器数量
  • 区分出不同荧光染料光谱的算法

在传统流式细胞术中，每种荧光染料都是在单个目标检测通道中进行检测，使用带通或长通滤光片收集发射光谱中的波峰处光谱信息。其他荧光染料会在这个目标检测通道中有发射光的荧光溢漏，这时通过补偿来做调节（图 1）。

图 1. 比较传统和光谱流式的光学检测配置 (A) 在传统流式上，使用单个检测通道来收集单个荧光染料的发射光信息，仅收集一部分发射光；通过补偿调节荧光溢漏误差。(B) 在光谱流式上，使用多个检测通道来收集所有荧光染料的全部发射光谱信息；通过解析区分不同荧光染料。

 

相比来说，全光谱流式细胞术是使用多个检测通道来检测的，获得每个激光下荧光染料的全部发射光谱信息，最终得到清晰的荧光光谱特征。重点是最终得到的完整光谱都是有其特征之处（图 2）。传统流式使用补偿来调节荧光溢出，而全光谱流式通过光谱解析来区别出每个荧光染料。光谱解析是通过数学算法，根据荧光染料的独特光谱特征，区分出多色样本中的单色荧光。通过这种方法，可以区分出波峰相近、完整光谱不同的荧光染料，最终在一个Panel中使用；而这在传统流式中不能实现。最后，光谱流式还可以从荧光信号中摘取细胞的自发荧光，提高数据结果准确性 [1,16]。

图 2. 光谱特征。多激光激发荧光染料得到其光谱特征。在上方示例中，每个激光激发、每个检测通道接收的荧光信号最终得到独特光谱特征。(A) 使用五激光 Cytek Aurora 光谱流式细胞仪，获得Invitrogen Brilliant Ultra Violet 737 荧光染料光谱特征。(B) 使用七激光Invitrogen Bigfoot 光谱流式分选仪，获得Invitrogen Brilliant Ultra Violet 737 荧光染料光谱特征。

 

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传统和光谱流式细胞术硬件的比较

常规（参见荧光分子探针学院——流式细胞术基础知识）和光谱流式细胞术都能够在单细胞水平上进行多参数分析。当前的光谱流式细胞术仪器使用与传统细胞术系统相似的流体技术来实现这一点，无论是通过流体动力学聚焦还是通过微流体芯片。这些系统通过流动池或腔室输送样品，其中单个细胞或颗粒可以在激光器询问之前对齐（图 1）。单个事件的激发通常由一组激光器执行，以确定与大小和粒度相关的细胞特性，当然还有存在的荧光特性。

对于所有流式细胞术实验，结合荧光染料的能力取决于激发波长特性和细胞仪的光学配置。多参数实验中荧光组合的相容性是激光波长和发射检测能力的直接结果。无论是传统的还是光谱的，单一荧光染料的发射模式在具有空间偏移激光器的系统与具有共线激光器的系统中可能是不同的。类似地，虽然共线系统存在于常规仪器和光谱仪器上，但由于收集光学器件的差异，任何两种荧光分子的相容性对于两种技术都可能不一致。

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参考文献和阅读材料
  1. Wade CG, et al.(1979) Spectra of cells in flow cytometry using a vidicon detector.J Histochem Cytochem 27:1049–52.
  2. Robinson, JP (2004) Multispectral cytometry: The next generation. Biophoton Int 36–40.
  3. Goddard G, et al.(2006) Single particle high resolution spectral analysis in flow cytometry.Cytometry A 69:842–51.
  4. Robinson, JP, Grégori, G, Rajwa, B, Jones, J, Patsekin, V. Multispectral detector and analysis system.Purdue University assignee USA patent 72,802,042,007 (2007).
  5. Gregori G, et al.(2011) Hyperspectral cytometry at the single-cell level using a 32-channel photodetector.Cytometry A 81:35–44.
  6. Futamura K, et al.(2015) Novel full‐spectral flow cytometry with multiple spectrally‐adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A 87: 830–842.
  7. Nolan JP, Condello D (2013) Spectral Flow Cytometry.Curr Protoc Cytom Unit1.27.
  8. Watson DA, et al.(2008).A flow cytometer for the measurement of Raman spectra.Cytometry A 73:119–28.
  9. Roederer M, et al.(1997) 8 color, 10-parameter flow cytometry to elucidate complex leukocyte heterogeneity.Cytometry A 29:328–39.
  10. De Rosa SC, Roederer M (2001) Eleven-color flow cytometry.A powerful tool for elucidation of the complex immune system.Clin Lab Med 21:697–712, vii.
  11. Perfetto SP, et al.(2004) Seventeen-colour flow cytometry: unraveling the immune system.Nat Rev Immunol 4:648–55.
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  16. Feher K, et al.(2016) Multispectral flow cytometry: The consequences of increased light collection.Cytometry A 69:681–689.
  17. Novo D, et al.(2013) Generalized unmixing model for multispectral flow cytometry utilizing nonsquare compensation matrices. Cytometry A 83A:508–520.