流式细胞术检测细胞周期-细胞周期流式结果分析-赛默飞

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流式细胞术可用于细胞周期分析，以检测特定细胞群中处于细胞周期不同阶段的百分比，也可搭配其他试剂，仅分析 S 期。

本页内容：

为什么流式细胞术是细胞周期分析的理想选择
活细胞周期分析染料及选择指南
固定细胞周期分析染料及选择指南

为什么流式细胞术是细胞周期分析的理想选择

当用细胞周期试剂染色时，细胞中的 DNA 会以化学计量方式结合染料，也就是说染料结合量与每个细胞中存在的 DNA 量成比例。分布在细胞周期各个阶段的DNA含量直方图是根据流式分析中的细胞数量与线性荧光数据得到的（图 1A）。然后可以使用现有的标准模型来确定特定细胞群中哪些细胞处于 G0/G1 期与 S 期、G2 或多倍体状态（图 1B）。

或者，可以使用双重标记实验在固定细胞中检测 S 期：先用 EdU（胸苷类似物）标记增殖细胞的 DNA 、用 Click-iT EdU 检测法检测，然后用 DNA 染料（如FxCycle 染料）染色（图 2）。该方法可以更准确地定量 S 期，因为胸苷类似物会选择性地结合到活跃分裂细胞的 DNA 中。

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图 1.流式细胞周期分析得到的 DNA 含量分布。(A)使用Vybrant DyeCycle Violet 染料对活 Jurkat 细胞染色得到的DNA含量分布直方图。G0/G1 和 G2/M 期直方图峰值由 S 期分布分开。使用 440 nm 带通滤波器进行 Violet 405 nm 激发。(B) 基于线性荧光和化学计量染色的 DNA 分布模式图。G2M 期 4N 细胞的荧光值是 G0/G1 期 2N 细胞的两倍。

图2.使用 FxCycle Violet Ready Flow 试剂和 Invitrogen Click-iT EdU Alexa Fluor 647 流式细胞分析试剂盒进行细胞周期分析。先用 10 µM EdU 处理 Jurkat 细胞（人 T 细胞白血病细胞系） 2 小时，再使用 Alexa Fluor 647 叠氮化物检测。随后加入 2 滴 FxCycle Violet Ready Flow 试剂进行细胞染色，并在 25°C 下孵育 30 分钟。使用 405 激光和 440/50 nm 发射滤光片在 Invitrogen Attune NxT 流式细胞仪上采集数据。细胞群分析结果如下：凋亡的亚 G1 期细胞占比 3.4%； G0/G1 期细胞占比 49.1%； S 期细胞占比 33.0%； G2M 期细胞占比 14.0%。

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活细胞周期分析染料—Vybrant DyeCycle 染料

我们提供用于细胞周期流式结果分析的经典细胞周期 DNA 染料，例如 Hoechst 33342 和 DRAQ5，但在使用这些染料做实验时必须考虑到它们的限制因素（请参阅活细胞周期染料选择指南），这也是我们开发用于活细胞周期分析的 Invitrogen Vybrant DyeCycle 染料的原因。

Vybrant DyeCycle 染料有以下特点：

精确——活细胞细胞周期分析结果准确
安全——低细胞毒性，后续可进行其他活细胞实验
可进行细胞分选——根据细胞周期的阶段轻松分选细胞
灵活——所有常见激光（UV、405、488、532 和 633 nm）均有相应的染料

图 3.分选后细胞生长状况的明场图像。用 5 µM 可 UV 激发的 Hoechst 33342、5 µM Vybrant DyeCycle Ruby 染料或 5 µM DRAQ5 DNA 染料进行 Jurkat 活细胞染色。细胞分选后培养 8 天，以检测细胞在染色和分选后的生长能力。据观察：与对照细胞相似，Hoechst 33342 和 Vybrant DyeCycle Ruby 染料染色后的 Jurkat 细胞具有特征性的葡萄状细胞群落。用 DRAQ5 染料染色的细胞没有明显的生长，表明该染料具有高水平的细胞毒性。

活细胞周期染料选择指南

	经典染料		优化的 Vybrant DyeCycle 染料
	Hoechst 33342*	DRAQ5	DyeCycle Violet*	DyeCycle Green	DyeCycle Orange	DyeCycle Ruby
激光激发 (nm)	UV, 405	633	UV, 405	488	488, 532	633
发射波长 (nm)	461	697	437	534	563	686
毒性	无毒	细胞毒性	无毒	无毒	无毒	无毒
细胞分选	可以	次优	可以	可以	可以	可以
实验时长	短期或长期	短期最好（<2小时）	短期或长期
注意事项	紫外线可能对活细胞产生不利影响可用于干细胞侧群研究 [1-3]	细胞毒性不利于活细胞分析	活细胞分析的其他颜色选项细胞分选实验的理想选择与 Hoechst 相比，在 405 nm 激光激发时，DyeCycle Violet 染料的 CV 更窄 DyeCycle Violet 染料可用于干细胞侧群研究 [5-7]
检测次数或体积	10 mL	200uL	200 次检测	200 次检测	200 次检测	100 次检测
货号	H3570	65-0880-92	V35003	V35004	V35005	V10309

*这些试剂还有即用型 Ready Flow 形式，无需计算、稀释或移液即可进行染色。

轻松将 DyeCycle 染料与其他活细胞实验结合

使用 Vybrant DyeCycle 染料可将细胞周期分析与其他活细胞实验（如 GFP 细胞分析、免疫表型分析、细胞分选、CFSE 细胞追踪和凋亡亚 G1 群体分析）简单结合起来。这些染料是可细胞渗透的核酸染料，无需细胞固定即可进入细胞核。

Vybrant DyeCycle 染料如果与其他染料共用，请先进行其他染料的染色，按照说明书操作，包括清洗步骤。应在最后一步加入 DyeCycle 染料，并且在流式分析之前不要清洗或固定样品。

使用 DyeCycle Violet 染料进行干细胞侧群鉴别

经验证，Vybrant DyeCycle Violet 染料可鉴别干细胞中的侧群（CD34^– 细胞），因此可以通过该表型来分离这种类型的细胞群（图 4）。侧群鉴别的基础是人类和啮齿动物干细胞会外排 Vybrant DyeCycle Violet 染料（以及 Hoechst 33342 染料）。可以用维拉帕米、伏马毒素C或其他阻断剂阻断染料外排，以便在这些干细胞中进行准确的 DNA 含量分析。

在 2013 年的《 Current Protocols in Cytometry》 [5-7] 中，Petriz 实验室证明使用 DyeCycle Violet 染料分离的细胞与使用 Hoechst 33342 分离的侧群细胞具有相同的表型特征。

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图 4.基于 Vybrant DyeCycle Violet 染料在人腺癌细胞中的外排差异鉴定干细胞。(A) 用 5 μM Vybrant DyeCycle Violet 染料染色 A549 细胞得到的 DNA 含量直方图不理想，因为染料会被 ABCG2 膜泵主动泵出细胞。(B) 用 ABCG2 抑制剂伏马毒素C (10 μM) 处理 A549 细胞会得到典型的 DNA 含量直方图，表明染料在细胞内的滞留。(C, D) Vybrant DyeCycle Violet 染料具有可检测到的较宽的荧光发射谱。VL1 与 VL3 的双参数图可以更好地区分侧群表型细胞：活跃外排 Vybrant DyeCycle Violet 染料并显示出侧群尾 (C) 的细胞，和用 ABCG2 膜泵抑制剂伏马毒素C处理的细胞(D）。

固定细胞周期分析染料——FxCycle 试剂

我们提供用于固定细胞周期分析的经典细胞周期 DNA 染料，例如 DAPI、PI 和 7-AAD，但这些试剂不能涵盖所有可用的激光激发光谱。FxCycle 试剂可选择 405 nm（紫色）和 633 nm（红色）激发，因此可将 488 nm 和 633 nm 激光用于其他细胞分析（例如免疫表型分析、细胞凋亡分析和死细胞识别），从而增加了每个实验可检测的指标的数量。请参阅固定细胞周期染料选择指南。

FxCycle 染料具有以下特点：

灵活性——可选择 405 和 633 nm 激光激发，提高细胞周期研究的多重性
更窄的 CV——由于发射光谱窄，需要极少补偿，因此分析更准确

固定细胞周期试剂选择指南

	DAPI	FxCycle Violet*	7-AAD	SYTOX AADvanced		PI	FxCycle PI/RNase	FxCycle Far Red
激光激发 (nm)	UV	405	488, 532	488, 532, 561		488, 532	488, 532	633
发射波长 (nm)	452	461	647,	647		617	617	658
注意事项	需要 UV 激光	发射光谱窄需要极少补偿	发射光谱宽需要大量补偿	光谱与 7-AAD 相似，但吸收更快更好的活、死细胞分离		发射光谱宽结合 DNA 和 RNA	含有 RNA 酶以防止 PI 与 RNA 结合仅能看到与 DNA 结合	633 nm 激光激发，是多重分析的理想选择
检测次数或体积	1 mL	500	2 mL	100	500	10 mL	200	500
货号	62248	F10347	00-6993-50	S10349	S10274	P3566	F10797	F10348

*FxCycle Violet 染料还有即用型 Ready Flow 形式，无需计算、稀释或移液即可进行染色。

FxCycle 染料流式数据

图 5.多参数细胞周期和免疫表型分析。 TF-1 成红细胞用酒精固定过夜，洗涤，然后重悬在 0.1% Triton X-100/PBS/1% BSA 中，然后用抗组蛋白 H3[pS10] 抗体（Zenon Alexa Fluor 488 Rabbit IgG 标记试剂标记）和 FxCycle Violet 染料进行染色。pH3信号（红色）识别处于有丝分裂中的细胞。

图 6.用 SYTOX AADvanced 死细胞染色试剂盒对混合的 Jurkat 细胞群进行染色，并使用用流式细胞仪进行分析。用 1 uM SYTOX AADvanced 死细胞染色试剂盒对热杀和未处理的 Jurkat 混合细胞染色 5 分钟。在配备有 488 nm 激光器和 695/40 nm 带通滤波器的流式细胞仪上分析细胞。活细胞很容易从死细胞群中区分出来。

图 7.FxCycle PI/RNase 染料染色的 Jurkat 细胞直方图显示 DNA 含量分布。将 Jurkat 细胞在 70% 乙醇中固定，洗涤，然后重悬于 FxCycle PI/RNase 染料中，室温孵育 30 分钟。G0/G1 和 G2/M 期直方图峰值由 S 期的分布分开。使用 532 nm 激发（585/42 nm 带通滤波器）进行分析。

图 8.FxCycle Far Red 染料染色后的的 TF-1 成红细胞直方图显示 DNA 含量分布。TF-1 细胞用酒精固定过夜，洗涤，然后重悬于 0.1% Triton X-100/PBS/1% BSA 中，然后在室温下用 FxCycle Far Red 染料加 RNase A 染色 30 分钟。G0/G1 和 G2/M 期直方图峰值由 S 期分布分开。使用 633 nm 激发（660/20 nm 带通滤波器）进行分析。