细胞毒性T细胞（CD8⁺T细胞）概述

细胞毒性T淋巴细胞（CTL细胞）通常称为CD8⁺T细胞，是适应性免疫系统的关键组成部分，在免疫系统抵御病原体（如病毒、细菌和肿瘤）中发挥重要作用[1]。 辅助性CD4⁺T细胞（如Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Tfh和Treg）是在胸腺中生成并表达αβ-T细胞受体或TCR，但与CD4⁺T细胞不同的是它们的表面表达CD8 ，并且对MHC I类的外源性抗原反应。

Naive/静息CD8⁺T细胞能够扩增和分化为细胞毒性效应细胞，监视机体并清除感染。若缺失CD8⁺T细胞 ，机体将缺少抗肿瘤免疫功能，不再对肿瘤生长有敏感 。CD8功能失调也可能引发过度的免疫反应，从而导致免疫介导的机体损伤或病理反应。一般情况下，循环和淋巴结驻留CD8⁺T细胞根据其分化状态细分为Naive T细胞、效应性T细胞和记忆性T细胞亚群。

CD8⁺T-αβ细胞发育始于胸腺的淋巴祖细胞，在胸腺细胞变成单阳性（SP）CD8⁺或CD4⁺胸腺细胞（图2）[2]之前，淋巴祖细胞先后经历双阴性（DN）（CD8^– CD4^–）阶段和双阳性（DP）阶段（CD8⁺ CD4⁺）。关于CD8⁺T细胞如何形成特异性，DP细胞通过与肽:MHC I类复合物的相互作用在胸腺皮质中进行阳性选择，生成CD8⁺SP细胞。随后这些SP细胞从皮质迁移到髓质，然后将在髓质中进行阴性克隆选择，以去除与自身抗原高亲和力结合的T细胞。最后，成熟单阳性CD8⁺T-αβ细胞被释放到循环中。

Naive CD8⁺T细胞可识别MHC I类分子（主要组织相容性复合体）上的抗原，当被活化后成为细胞毒性CD8⁺T细胞（CTL）（图3）。树突状细胞（DC）等抗原呈递细胞（APC）通常在MHC I类分子中呈递内源性抗原肽，它们被TCR和CD8⁺T细胞上的CD8⁺共受体识别。DC呈递那些因病毒感染或肿瘤细胞引起改变的多肽，然后通过TCR结合活化抗原特异性的CD8⁺T细胞。

CD8⁺T细胞活化还需要额外的共刺激信号（如CD80/86信号），以及DC和活化CD4⁺T细胞分泌的细胞因子[2]。大多数CD8⁺T细胞活化都需要CD4⁺T细胞，以帮助CD8充分活化和上调共刺激信号并达到佳刺激状态。非CD4依赖性激活也可发生在某些感染因子上，如病毒和细菌，它们通过刺激toll样受体或诱导IL-1或I型干扰素的释放来激活DC。活化后，CD8⁺T细胞经历克隆扩增以形成表型和功能异质性效应细胞（其主要活动是清除受影响的靶细胞）。大多数效应细胞寿命都不长，在清除感染或肿瘤细胞后出现凋亡。小部分（5-10%）以不同的表型作为长寿命记忆性细胞存活下来；组织驻留记忆T细胞(tissue resident memory T cells, Trm)存在于发起原发反应的组织中、中枢记忆T细胞(Tcm)在次级淋巴组织中循环，效应记忆T细胞(Tem)在非淋巴组织中循环。

细胞毒性T细胞或细胞毒性CD8⁺T淋巴细胞（CTL）对靶细胞的杀伤可通过多种机制实现，并涉及一系列“精心策划”的事件，通常最终导致靶细胞的凋亡和清除（图4） 许多CTL细胞通过释放细胞毒性颗粒来传递促凋亡分子，从而发起对靶细胞杀伤。TCR与MHC I类结合可促使储存在胞质溶胶中的穿孔素和颗粒酶合成。一旦结合，颗粒酶就被释放，则特异性靶向邻近的细胞使其死亡。穿孔素聚集在靶膜中，使颗粒酶进入靶细胞。颗粒酶是一组能活化半胱天冬酶的丝氨酸蛋白酶，可导致细胞死亡。

细胞间的直接接触非常重要。CD8⁺T细胞可结合表达于淋巴细胞和受感染靶细胞上的Fas受体和Fas配体（Fas L）从而诱导凋亡。此外，活化CD8⁺T细胞还可生成多种有助于宿主防御的细胞因子（包括IFNγ、TNFα和淋巴毒素-α）。IFNγ在增加MHC I类分子表达的同时抑制病毒复制，增加对感染细胞的识别。

抗病毒免疫作用：病毒感染后一周内，naive CD8⁺T细胞分化为效应细胞。病毒抗原被固有免疫细胞上的多种模式识别受体识别，从而导致I型干扰素生成，而I型干扰素又介导效应性CD8⁺T细胞反应的发展。由巨噬细胞和DC产生的IL-12能诱导T-bet，其介导细胞获得抗病毒细胞毒性功能。TNFα、IL-15和 IL-18等其他细胞因子可进一步增强CD8⁺T细胞反应。

抗肿瘤免疫作用：CD8⁺T细胞被视为抗肿瘤免疫的主要驱动因素[3]。CD8⁺肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）通过识别肿瘤抗原和直接杀死转化细胞来介导肿瘤排斥反应。肿瘤微环境中的效应性CD8⁺T细胞可生成IL-2、IL-12和IFNγ，提高CD8⁺T细胞的细胞毒能力，导致靶向肿瘤细胞杀伤。肿瘤微环境中的细胞毒性CD8⁺T细胞水平升高与各类癌症的抗肿瘤作用和预后改善有关。

Niave CD8⁺可以分化为多种作用不同的效应细胞[4]。效应表型的特征是细胞毒性强并可生成细胞因子。靶细胞的杀伤是由CTLs完成的，CTLs属于Tc1细胞。其他由不同细胞因子环境产生的CD8⁺ T-αβ细胞亚群包括Tc2、Tc9、Tc17和CD8⁺调节性T细胞[5].像各种辅助性T细胞亚群一样，这些细胞表达特异转录因子，并生成特征性的细胞因子和效应分子（表1）。

例如，细胞毒性Tc1细胞在IL-2和IL-12存在的情况下生成，并能够分泌细胞因子（如IFNγ）。此外，细胞毒性Tc1细胞还会生成参与细胞溶解的分子（如颗粒酶B和穿孔素）。Tc1细胞涉及的转录因子包括T-bet、blimp-1和IRF-4。与此相反，Tc2细胞在IL-4存在的情况下被诱导并能分泌IL-5和IL-13。Tc2细胞是由谱系特异性转录因子GATA3调控产生的。与Tc1细胞不同，Tc2细胞仅表现出低水平的细胞毒性，并且经证明可导致过敏和加剧自身免疫。

衰老的CD8+CD28-T细胞表现出失能或调节性衰竭，其增殖能力降低，细胞毒性低，分泌IL-10和具有抑制潜力。在头、颈和肺癌研究中已鉴定出CD8⁺Tregs群体。同样，衰竭CD8⁺T细胞表达PD-1、CTLA-4、TIM3、LAG3等受体；它们执行免疫抑制功能并介导免疫逃避。

表 1.效应性CD8⁺T细胞表型和功能。

T-αβ细胞亚群可根据其效应记忆分化状态进一步分型[3，5]。这些记忆性CD8⁺T细胞的特征如下：具有自我更新能力、存在于淋巴组织和非淋巴组织中、以及在随后遇到相同抗原时发挥记忆效应功能。 记忆性CD8⁺T细胞根据效应功能、增殖能力和组织归巢特性方面的差异分为不同亚群：

• 中枢记忆性细胞（Tcm）：这些细胞主要位于淋巴组织，并表达淋巴归巢分子CD62L和CCR7。
• 效应记忆性细胞（Tem）：这些细胞是抵御感染的第一道防线。它们介导即时效应功能，存在于循环和非淋巴组织中，并表达低水平的淋巴归巢分子CD62L和CCR7。
• 组织驻留记忆性细胞（Trm）：这些细胞位于粘膜层。

CD8⁺T细胞的保护性反应通过这些效应和记忆亚群的共同作用实现。 表2和表3突出了用于鉴定小鼠和人CD8⁺T细胞主要亚群的标志物。小鼠CD8⁺T细胞的标志物包括CD3、CD5、CD8、CD27和CD28；人CD8⁺T细胞标志物包括CD2、CD3、CD5、CD8、CD25⁺⁺、CD27和CD28。

CD8⁺亚群的检测相对简单。大多数实验都通过对特定的人CD8⁺T细胞进行表型分析来检测或分离亚群，如“优化多色免疫荧光组合”（OMIP）所述[6]。评估T细胞活化、增殖和分化的其他方法包括检测亚群的细胞因子分泌。

表 2.CD8⁺T细胞亚群及其研究方法概述。

从PBMC或肿瘤组织中分离CD8⁺T细胞是体外或体外刺激后研究其表型和功能特性的重要要求。抗体介导的分离（如免疫磁珠分选试剂盒）是分离CD8⁺T细胞最常用的方法。理想的分离方法速度应较快，产量高，活性好，纯度高。IL-2应添加到培养基中，因为它对CD8/CTL的扩增、存活和功能至关重要[7，8]。

表 3.用于识别小鼠CD8⁺T细胞不同亚群的细胞标志物。

表 4.用于识别人CD8⁺T细胞不同亚群的细胞标志物。

穿孔素和颗粒酶B的检测：脱粒试验可评估CD8+T细胞潜在细的胞毒性。活化的效应CD8+T细胞可释放溶细胞颗粒穿孔素和颗粒酶B，从而诱导杀伤肿瘤或病毒感染细胞。可以使用流式细胞术监测脱粒。图6显示了使用穿孔素和颗粒酶特异性抗体来检测CD8+T细胞潜在的细胞毒性。

图6.检测穿孔素和颗粒酶B（A）使用下述抗体通过包内染色来实现对正常人外周血细胞检测，Invitrogen CD8a单克隆抗体（克隆号RPA-T8）、APC-eFluor 780、eBioscience（货号47-0088-42）以及Invitrogen小鼠IgG2b kappa同型对照（克隆号eBMG2b）、FITC、eBioscience（货号11-4732-42）（左）或Invitrogen穿孔素单克隆抗体（克隆号delta G9）、FITC eBioscience（货号 11-9994-42）（右）。右图的细胞分析都是基于对淋巴细胞设门的。（B）使用下述产品对正常人外周血进行细胞内的染色：Invitrogen eBioscience Intracellular Fixation&Permeabilization Buffer Set（货号88-8824-00）、Invitrogen CD8a单克隆抗体（克隆号RPA-T8）、APC、eBioscience（货号17-0088-42）以及Invitrogen小鼠IgG2a kappa同种型对照（克隆号eBM2a）、eFluor 450、eBioscience（货号48-4724-82）（左）或Invitrogen颗粒酶B单克隆抗体（克隆号N4TL33）、eFluor 450、eBioscience（货号 48-8896-42）（右）。右图的细胞分析都是基于对淋巴细胞设门的。

CD107/LAMP-1的检测：CD107/LAMP-1动员是衡量杀伤细胞的细胞毒性潜能的指标。 CD107a糖蛋白排列在静止T细胞的腔表面。活化后，溶解颗粒与靶细胞相互作用，并与质膜融合。在此过程中，颗粒酶和穿孔素被胞吐，细胞表面表达CD107。可以使用流式细胞技术检测CD107/LAMP-1（图7）。

为了在体外多克隆活化CD8⁺T细胞，可以使用Invitrogen Invitrogen Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28培养分选的naive CD8+ T细胞3–4 天，能实现T细胞扩增和活化（图8）。Human T-activator Invitrogen Dynabeads通过模拟树突状细胞在体外诱导CD3/CD28介导的T细胞活化。激活后的细胞可以进一步与细胞因子和感兴趣的化合物一起培养，以进行分化和细胞因子分析。应在细胞培养基中加入IL-2，以维持CD8⁺T细胞[7，8]。T细胞的扩增是有限的，因此，可以用细胞增殖试剂来检测增殖。

溶细胞活性是CD8⁺T细胞的主要功能，已经有几种测定方法来检测[9]。

铬（⁵¹Cr）释放细胞毒性试验：这个试验被认为是评估细胞介导的细胞毒性的金标准。其依赖于铬酸钠标记的靶细胞对⁵¹Cr的结合和被动内化。效应杀伤细胞溶解靶细胞会导致放射性Cr释放到细胞培养上清液中，因此可通过γ-计数器进行检测。由于这种方法是半定量性质和灵敏度不高，因此具有局限性，并且在再次刺激效应细胞时在技术上有难度，即细胞的实际行为可能会偏离其原始状态。 钙黄绿素AM是⁵¹Cr的替代品，可用于类似的分析。

膜联蛋白V结合的细胞毒性试验：膜联蛋白V对磷脂酰丝氨酸（PS）具有高亲和力，而磷脂酰丝氨酸通常存在于质膜的内小叶中。在诱导细胞凋亡时，PS位于外表面，因此其可与膜联蛋白V结合。它提供了一种方便的基于流式细胞术的检测效应细胞杀伤活性的方法。 在这种细胞毒性试验中，可以用PKH26或CD8⁺特异性抗体标记效应细胞，并一起培养效应细胞与靶细胞。可以通过 FITC or PE偶联的膜联蛋白V来检测靶细胞的凋亡。此外，共同检测膜联蛋白V与PI或细胞对7-AAD摄取有助于区分靶细胞凋亡的不同阶段。
 

炎性细胞因子（如IL-12和1型干扰素、IL-2、IL-21和IL-27）影响活化的CD8⁺T细胞的扩增。IFN、IL-2和IL-21等细胞因子对于决定短期效应细胞和记忆前体CD8⁺T细胞的生成发挥重要的作用。 细胞毒性CD8⁺T细胞通过分泌穿孔素和颗粒酶以及释放细胞因子（如IFN-γ和TNF-α）来清除感染。IFN-γ可以抑制病毒的复制，并可以将巨噬细胞募集到感染部位，同时在此处与TNF-α协同活化巨噬细胞。下表总结了一些可用于分析CD8⁺T细胞表达谱的免疫试验。

多因子免疫测定