ELISA 概述

ELISA（酶联免疫吸附检测）是一种平板检测技术，旨在检测和定量肽、蛋白质、抗体和激素等物质。其他名称，比如酶免疫测定（EIA）也用于描述该的技术。在 ELISA 中，抗原必须固定化到固体表面，然后与连接到酶的抗体混合。通过与适当的底物孵育，测量报告基因酶的活性来产生可测量的产物，从而实现检测。该检测策略中的最关键元素是高度特异性的抗体-抗原相互作用。

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酶联免疫吸附测定 (ELISA) 是一种检测和定量复杂混合物中特定蛋白质的强大方法。该方法最初由 Engsorvall 和 Perlmann (1971) 描述，可使用特异性抗体分析固定在微孔板孔中的蛋白样品。ELISA 通常在96孔（或384孔）聚苯乙烯孔板中执行，它们可与抗体和蛋白质被动结合。试剂的这种结合和固定化使 ELISA 容易设计和执行。让 ELISA 的反应物固定化到微孔板表面，使其容易在检测过程中把结合与未结合材料分开。具备洗掉非特异性结合材料的能力，使 ELISA 成为粗品制备中测量特异性分析物的强大工具。

尽管 ELISA 的许多变体已经在不同的情况下开发和使用，但它们都依赖于相同的基本元件：

1. 包被 / 捕获—直接或间接将抗原固定在聚苯乙烯微孔板孔表面。
2. 板封闭—添加不相关蛋白质或其他分子，以覆盖微孔板孔中所有不饱和表面结合位点。
3. 检测 / 检测—用与抗原结合的抗原特异性抗体进行培养。
4. 信号测量—检测特异性抗体上直接或二次标记产生的信号。

最常用的酶标记是辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。其他酶也已使用；这些酶包括 β - 半乳糖苷酶，乙酰胆碱酯酶和过氧化氢酶。使用 HRP 或 AP 偶联物执行 ELISA 时提供广泛的底物选择。底物选择取决于所需的检测灵敏度和可用于信号检测的仪器（光吸收酶标仪、荧光酶标仪或发光酶标仪）。

ELISA 使用有多种方法。这些分为直接，间接或夹心法捕获和检测方法。关键步骤是固定目标抗原，通过直接吸附到检测板或通过已附着在检测板上的捕获抗体间接完成。然后可以直接（标记一抗）或间接（标记二抗）检测抗原。最广泛使用的 ELISA 检测形式是夹心式 ELISA 检测，可间接固定和间接检测是否存在靶抗原。这种类型的捕获检测称为“夹心”检测，因为待测分析物结合在两种一抗之间，每种一抗检测抗原的不同表位——捕获抗体和检测抗体。由于其灵敏度和特异性，夹心 ELISA 方法被高度使用。

在上面讨论和说明的标准检测方法中，捕获和检测的差异是值得关注的，采用专门用于检测步骤的特定策略非常重要。与在孔板上捕获抗体所采用的方法无关（通过直接吸附到表面，或者通过预包被“捕获”抗体，与在夹心法 ELISA 中相同），检测步骤（直接或间接检测）很大程度上决定了 ELISA 的灵敏度。

直接检测方法使用经报告酶标记的一抗或带有与抗原直接反应的标记的一抗。执行直接检测时可以使用直接固定化到检测板上的抗原或者采用捕获检测形式。虽然直接检测在 ELISA 中未广泛使用，但是在组织和细胞的免疫组织化学染色中却很常见。

间接检测方法使用标记的二抗或生物素-链霉亲和素复合物进行扩增，是最常用的 ELISA 形式。二抗对一抗具有特异性。在夹心法 ELISA 中，关键是二抗仅对检测一抗（而不是捕获抗体）具有特异性，或者该检测对抗原不具有特异性。通常，通过使用来自不同宿主的捕获抗体和一抗（例如分裂来自小鼠 IgG 和兔 IgG）可实现这一目的。对于夹心法检测，使用已经交叉吸附的二抗有利于清除任何可能对捕获抗体有亲和力的二抗。

直接，间接和夹心 ELISA 检测方法的比较

除了上述的标准直接和夹心法形式，还存在其他几种 ELISA 形式：

竞争性 ELISA 是在抗原较小或只有一个抗原决定簇或抗体结合位点时使用的一种策略。该方法的一个变化在于它包含标记纯化抗原而非抗体。来自样品的未标记抗原和标记抗原为了与捕获抗体相结合而竞争。与单独使用标记抗原的检测孔进行比较，来自纯化抗原的信号减少表示样品中存在抗原。

ELISPOT（酶联免疫斑点检测）指的是对接种到由 PVDF 膜提供支持的微孔板微孔中的细胞所分泌的蛋白质进行类似于 ELISA 的捕获和测量。它属于“夹心法”检测，其中，蛋白质是在局部被捕获的，因其是平板接种细胞分泌的，并且检测是使用沉淀底物进行的。ELISPOT 与蛋白质印迹法类似，其结果是膜表面的斑点。

细胞内 ELISA 使用在标准微孔板内通宵平板接种并培养的细胞来执行。培养细胞被固定、透性化和封闭后，使用抗体检测靶蛋白。这是直接检测，不属于夹心法检测。二抗为荧光（适合使用荧光板读数仪或显微镜进行直接测量）或酶偶联（适合平板读数仪使用可溶性底物进行检测）抗体。

ELISA 几乎总是使用96孔或384孔聚苯乙烯平板和溶液（即生物体液、培养基或细胞裂解液）中的样品来执行。本文章剩余部分将讨论该平台。

为特异性抗原开发 ELISA 时，第一步是为抗原或捕获抗体优化平板包被条件。首先选择检测微孔板（不是经过组织培养处理的平板），最低蛋白结合力为400 ng/cm²。同样重要的是，蛋白质结合的 CV 值（变异系数）应较低（首选 <5%），以便本应相同的微孔和平板间检测结果中的数值的偏差有限。平板颜色的选择取决于要检测的信号。透明聚苯乙烯平底反应板用于比色信号，而黑色或白色不透明反应板用于荧光和化学发光信号。使用前目测检查反应板塑料是否有瑕疵或划损，否则从开发的检测采集数据时会引起畸变。Thermo Scientific 未包被 ELISA 反应板提供多种表面，以使用您首选的大分子优化包被。这些反应板旨在得出最佳结果，实现批次间的可靠性和各孔之间的可重复性。

通过将蛋白质被动吸附到检测微孔板的塑料上，实现平板包被。该过程是通过塑料和非极性蛋白质残基之间的疏水作用来完成的。尽管个别蛋白质需要特定条件或预处理来优化结合，包被平板最常见的方法包含添加 2-10 μg/ml 蛋白质溶于碱性缓冲液（比如磷酸盐缓冲盐水（pH 值 7.4）或碳酸盐-重碳酸盐缓冲液（pH 值 9.4））后的溶液。让平板在 4-37° C 条件下培养数小时至通宵。通常，在清除包被溶液后，添加封闭缓冲液以确保覆盖塑料孔所有剩余可用的结合表面（参见后续讨论）。包被平板可以立即使用，或者干燥后储存在 4° C 条件下供以后使用，视包被蛋白质的稳定性而定。

请务必注意，最佳包被条件和平板结合力因每种蛋白质而异，必须通过实验确定。除了竞争 ELISA 以外，包被平板的捕获蛋白数量超过检测过程中实际可结合数量，是为了促进检测实现可能最大的工作范围。一些蛋白质，尤其是抗体，在平板上实现最佳包被时的浓度低于其最大结合力，是为了防止非特异性蛋白在随后的步骤中出现称为“钩状效应”的现象。蛋白质被困在包被蛋白之间产生钩状效应，妨碍了有效清洗和清除未结合的蛋白。当钩状物非特异性捕获一抗和二抗的检测时，会产生高背景信号，从而降低检测的信噪比和灵敏度。

对于抗体和蛋白质，通过被动吸附来包被平板通常效果良好。但是被动吸附也可能引起问题，包括定位不当、变性、固定化效率低下以及污染物和靶分子结合不良。多种类型的预包被板可帮助缓解这些问题。预包被 蛋白 A ， G 或 A/G 的板有助于正确捕获抗体并保持抗原结合能力。使用谷胱甘肽、金属螯合物或捕获蛋白包被的平板可以将融合蛋白沿正确方向连接到微孔板上。 肽和其他小分子，通常通过被动吸附无法有效结合，可以进行生物素化并高效连接到链霉抗生物素蛋白或 NeutrAvidin 蛋白包被平板上。生物素化抗体还可以固定到预包被生物素结合蛋白的平板上。以这种方式使用预包被平板，可以从平板表面物理分离抗原或捕获抗体，作为应对其变性作用的保护措施。聚合物涂层和经修饰的表面可用于帮助增加被动吸附。高性能表面包被平板（预包被和预封闭）提供96孔和384孔形式（黑色、透明或白色）的广泛选择。这些包被的微孔板可用于 ELISA 开发和其他基于微孔板的检测，使用光吸收、荧光或化学发光酶标仪进行检测。

ELISA 用不同类型的微孔板

以下示例举例说明了聚合物包被的变化如何影响蛋白质结合力。

单克隆或多克隆抗体可用作夹心 ELISA 和其他 ELISA 系统中的捕获和检测抗体。单克隆抗体对单个抗原决定簇具有固有的单特异性，可对抗原内的细微差异进行精细检测和定量。多克隆抗体通常用作捕获抗体，用于沉降尽可能多的抗原。然后单克隆抗体用作夹心法检测中的检测抗体，用于改善特异性。除了使用传统单克隆抗体，重组单克隆抗体也可以用于 ELISA。例如，Invitrogen 兔重组抗体来自于产生抗体的细胞系，该细胞系采用工程技术后可表达特异性抗体重链和轻链 DNA 序列。与源自杂交瘤的传统单克隆抗体相比，重组抗体不易发生细胞系漂移或批次间变化，因此可实现峰值抗原特异性。

设计夹心法 ELISA 的一个重要考虑因素是捕获抗体和检测抗体必须识别两种不同的不重叠的抗原决定簇。抗原与捕获抗体相结合时，不得掩盖或改变检测抗体识别的抗原决定簇。彼此互不干扰且可同时结合的捕获抗体和检测抗体被称之为“匹配对”，且适用于开发夹心法 ELISA。很多一抗供应商提供关于抗原决定簇的信息，并指出已在 ELISA 中经过校验可作为匹配对的抗体对。使用相同的抗体进行捕获和检测会限制最终 ELISA 的动态范围和灵敏度。

微孔板孔的结合力通常高于每个孔中包被的蛋白质数量。剩余表面积必须封闭，防止抗体或其他蛋白质在后续步骤中吸附到平板上。封闭缓冲液是由无关蛋白质、蛋白质混合物或被动吸附到平板所有剩余结合表面的其他化合物组成的溶液。如果通过减少背景信号并提高信噪比可改善检测灵敏度，则封闭缓冲液有效。理想的封闭缓冲液将结合到发生非特异性相互作用的所有可能位点，完全消除背景，而未改变或掩盖抗原决定簇进行抗体结合。

开发任何新的 ELISA 时，请务必在检测中针对最高信噪比测试几种不同的封闭剂。很多因素会影响非特异性结合，包括有关样品和抗体所特有的各种蛋白质间相互作用。选择封闭剂时的最重要参数是信噪比，它是使用包含目标分析物的样品获得的信号与使用不含目标分析物的样品获得的信号进行比较后得出的测量结果。使用数量不足的封闭剂将导致背景过度和信噪比下降。使用过高浓度的封闭剂可能掩盖抗体-抗原相互作用或者抑制酶作用，再次引起信噪比下降。不存在适合每种情况的封闭剂，实证检验对于实现封闭步骤的真正优化至关重要。

除了封闭之外，重要的是在 ELISA 每个步骤之间执行彻底清洗。清洗步骤对于移除未结合试剂、降低背景从而提高信噪比必不可少。清洗不充分可能造成高背景，同时，过度清洗可能因从孔微孔中洗脱抗体和/或抗原导致灵敏度下降。清洗在生理缓冲液中执行，比如不含任何添加剂的 Tris-缓冲生理盐水（TBS）或磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）。通常，在缓冲液中加入洗涤剂，比如 0.05% 的吐温20，有助于移除非特异性结合的材料。另一种常见的技术是使用封闭缓冲液的稀释溶液并加入一些洗涤剂。清洗缓冲液含有封闭剂并加入洗涤剂有助于将检测中的背景降至最低。为了获得最佳结果，请使用高纯度洗涤剂，防止引入杂质，以免干扰检测此类酶抑制剂或过氧化物。

检测步骤是所有 ELISA 系统中的最终阶段。除非使用放射或荧光标记，该步骤包含引入酶底物。酶将底物转化为可检测的产物。如果 ELISA 已妥善构建和开发，则添加底物时产生的信号强度与平板中捕获并与检测试剂结合的抗原数量成正比。酶偶联抗体（尤其是包含辣根过氧化物酶（HRP）的抗体）为 ELISA 提供了最大的检测灵活性和成像方法），因为可用于显色、化学荧光和化学发光成像的底物丰富多样。

比色底物形成一种可溶性有色产物，随着时间的推移，该产物会与每个孔中存在的酶量成比例。当达到所需的颜色强度时，可以直接测量产品吸光度，也可以在某些情况下添加终止液，以提供固定的终点检测。比色底物可用于辣根过氧化物酶 (TMB ， OPD ， ABTS) 和碱性磷酸酶 (PNPP)。尽管不像荧光或化学发光底物那么灵敏，ELISA 显色底物也可实现直接显像并执行动力学研究。另外，使用标准吸光度板读数仪检测 ELISA 显色底物也是很多实验室的常见做法。

化学发光是一种化学反应，会产生光释放的能量。大多数化学发光底物依赖 HRP ，但某些 AP 同等产品可供选择。最常用的方法是在存在 HRP 和过氧化物缓冲液的情况下使用鲁米诺。鲁米诺被氧化，形成了一种激发状态的产品，随着光线衰减到地面状态而发出光线。只有酶底物反应时才会发生光发射，因此当底物变为耗尽时，信号停止。化学发光检测通常比比比色检测更灵敏。将化学发光底物用于 ELISA 的一个缺点是信号强度比其他底物变化大。对于需要读取很多平板的检测，如果在平板读数之前信号开始衰减，就会出现问题。为此，请务必确保检测已使用该底物进行优化，避免将样品内的信号衰落误判为低抗原丰度。HRP 的化学发光底物包括 Thermo Scientific SuperSignal ELISA Pico 和 ELISA Femto 底物。

荧光 ELISA 底物不那么常用，并且需要荧光计产生正确激发光束，以引起荧光标记生成信号发射。化学荧光检测也是基于酶的，但生成的产品是荧光而非比色的。使用具有适当激发和发射滤光片的荧光计测量信号。在动力学分析中可以随时间测量化学荧光反应，也可以使用终止液直接测量。HRP 的化学荧光底物示例包括 Thermo Scientific QuantaRed 和 QuantaBlu 底物。

除了本文章剩余部分讨论的个别组分和 ELISA 一般原则，即用型夹心法 ELISA 试剂盒在商业上已可用于检测作为共同研究目标的数百钟特异性细胞因子、神经生物学分析物和磷酸化蛋白质。

为很多靶标提供两种试剂盒类型：

• ELISA 试剂盒包含预包被抗体反应板、检测抗体、缓冲液、稀释液、标准品和底物。除了传统的 ELISA 试剂盒之外，还可提供即时 ELISA 试剂盒板，其中包含所有必要成分，包括捕获抗体和冻干检测抗体，链霉亲和素 -HRP 和样品稀释剂。此外，可单独提供包含标准曲线标准品的联排孔，以便完全使用 96 孔进行检测样品。

• 未包被 ELISA 试剂盒—这些试剂盒配有包被自己平板所需的所有试剂，以及除终止液和洗涤缓冲液外运行检测。
• 抗体对试剂盒—这些试剂盒含有经过优化的匹配抗体，适合夹心 ELISA 开发和标准品 (无板或检测试剂)。

本 ELISA 方法选择指南比较了 Thermo Fisher Invitrogen 抗体对试剂盒与 ELISA 试剂盒的特性。

1. John R. Crowther, Methods in Molecular Biology, The ELISA Guidebook.Humana Press, a part of Springer Science + Business Media, LLC 2009.
2. Butler J.E.The Behavior of Antigens and Antibodies Immobilized on a Solid Phase.M.H.V.Van Regenmortel, ed. Structure of Antigens.Boca Raton, FL: CRC Press, 1992: 209-259.Vol.1, 209; CRC Press, Inc.
3. Lequin, Rudolf M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Clinical chemistry 51.12 (2005): 2415-2418.
4. Engvall, Eva, and Peter Perlmann.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 8.9 (1971): 871-874.
   
   

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