一步法 RT-PCR 系统

SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统借助创新型技术，无需对每对引物的退火温度（Tm 值）进行优化。60 ℃ 的通用退火温度适用于大部分引物对，有助于尽量减少优化步骤，节省时间，并避免配制反应体系时可能出现的错误（图1）。

图1.在两种退火温度条件下进行一步法 RT-PCR 扩增。从 10 ng 人类通用参考 RNA (UHRR) 中扩增 9 个靶点；第一批使用 60 ℃ 的通用退火温度进行扩增（左侧）；第二批使用 Tm 计算器计算得到的 Platinum SuperFi DNA 聚合酶的退火温度进行扩增（右侧）。所使用的分子量标准为 Thermo Scientific GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (即用型)。

SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统的出色灵敏度有利于低丰度靶标的检测（图2）；即使 RNA 起始量非常有限，也能进行一步法 RT-PCR 扩增。

图2.从低起始量 RNA 样本中进行靶标检测。使用 SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统将 1 μg UHRR 连续稀释至 0.01 pg，从中扩增 0.43 kb 的片段。所使用的分子量标准为 Thermo Scientific GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (即用型)。

SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统可耐受常见的 RT 和 PCR 抑制剂(如与样本一起纯化出来的化合物或者 RNA 纯化时所用的试剂) 的影响。这种出色的稳定性可减少系统对 RNA 样本纯度的依赖，有助于获得可靠的实验结果。其他一步法 RT-PCR 试剂盒中的酶受到了抑制剂的抑制（图 3）。

图3.对抑制剂的耐受性。使用 SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统或其他一步法 RT-PCR 试剂盒，从100 ng UHRR 中检测 1 kb RNA靶标，反应混合物中含有：(1)无抑制剂，(2)木聚糖 (2.5 μg/μL), (3)腐植酸 (15 ng/μL)，(4)SDS (0.013%)，(5)硫氰酸胍 (1.2%) 或(6)氯化锂 (2.5 μg/μL)。

借助创新的两阶段热启动激活机制，SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统可实现室温下进行反应体系配制和所配制反应体系的长时间室温稳定性。即使在室温下放置较长时间，也能观察到高效的特异性扩增。

• 对于 3 kb 以内的靶标，配制的反应体系在室温下放置24小时后仍能成功扩增（图 4A）
• 对于较长的靶标，配制的反应体系可在室温下放置长达4小时（图 4B）

借助 SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统中具有高持续合成能力酶的组合，可实现对多种长度靶标的扩增（图5）。只需短短 10 分钟即可合成全长 cDNA，而 PCR 步骤的延伸速度为 30 秒/kb，这使其成为各种一步法 RT-PCR 试剂盒中耗时最短的方案之一。

图5.适合检测多种长度范围的靶标。使用 SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统和其他一步法 RT-PCR 试剂盒，在 0.2 到 9.4 kb 范围内检测 RNA 靶标片段。

在含染料的产品中，SuperScript IV RT 混合液中含有红色示踪染料，UniPrime RT-PCR 预混液中含有蓝色示踪染料。在配制反应体系时将这两种溶液进行混合，最终的反应混合液变成紫色，以此实现反应体系配制的可视化示踪，从而防止出现移液失误（图 7）。

可以。SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统可以在 60 ℃ 通用引物退火温度下运行，也可以在经 Tm 计算器得到的引物退火温度下运行。

良好的实验室操作规范对于长片段的一步法 RT-PCR 扩增非常重要。包括使用高质量的模板（高纯度、新鲜和完整）和新鲜的引物。需要考虑的优化步骤包括按照推荐实验方案里适当延长延伸时间，以及增加模板量。访问我们的反转录学习资源，了解更多关于 RT-PCR 反应优化和体系配制的信息。

相比其他多种一步法 RT-PCR 产品，SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统可在更高的温度下进行 cDNA 合成。对于 GC 含量高或结构复杂的 RNA 模板，建议将 cDNA 合成孵育温度提高到 55-65 ℃。

SuperScript IV 一步法 RT-PCR 系统和 SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统均采用两阶段热启动激活机制，确保在一步法 RT-PCR 实验流程中可连续性激活 RT 酶 和 PCR 酶。在室温下，SuperScript IV RT 由于热敏 RT 封闭剂的作用保持未激活状态。在大约 45 ℃ 的第一热启动激活阶段，RT 封闭剂被释放，之后开始第一链 cDNA 合成。在第二个激活阶段，反应被加热到 98 ℃，DNA 聚合酶被激活，同时使 SuperScript IV RT 失活。此机制将 RT 酶和 PCR 酶的活性区分开，可获得 RT-PCR 的高特异性和高产量。

SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统扩增后生成平端 PCR 产物，可直接克隆进平端克隆载体。如果在 PCR 后加入 3'dA-突出末端，也可以进行 TA 克隆。访问 PCR 学习中心，详细了解如何使用不同的 PCR 酶进行分子克隆。

含染料形式的 SuperScript IV 一步法 RT-PCR 系统中的红色和蓝色示踪染料不会对 E-Gel 琼脂糖凝胶电泳造成干扰。遵循具体的 E-Gel 操作建议，将样本稀释 2 - 30 倍，使用 E-Gel 预制琼脂糖凝胶可获得较佳的分离结果。

SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统中含有 2X UniPrime RT-PCR 预混液，其中包含改进的 Invitrogen Platinum SuperFi II DNA 聚合酶，由于其具备高特异性和高产量，所以对序列准确性要求较高的实验应用来说，无疑是较理想的选择。与其他校正酶不同，这种聚合酶能与 dUTP 兼容。

可以。可以使用 SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统在室温下配制反应体系。除此之外，得益于创造性的两阶段热启动激活机制，在室温下，若靶标长度小于 3 kb，配制好的反应体系可保持 24 小时的稳定性；若靶标长度 >3 kb，配制好的反应体系可保持 4 小时的稳定性。