图1：模板转换反转录和 cDNA 扩增示意图。
直接反转录试剂盒旨在直接从细胞裂解物中合成 cDNA，而无需提取 RNA，可用于单细胞分析。细胞裂解和反转录在同一反应管中进行。合成的第一链 cDNA 可直接用于 PCR 和 qPCR 等下游实验应用。
Cells-to-cDNA 试剂盒: 选择指南
表1：Cells-to-cDNA 试剂盒的比较
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| 预期用途 | 直接从哺乳动物细胞裂解物中进行第一链 cDNA 合成 | 模板转换反转录和全长 cDNA 整体预扩增 |
| 是否需要进行 RNA 纯化 | 否 | 否 |
| 起始材料 | 1-10,000 个细胞 | 1-1,000 个细胞 2 pg-10 ng 总 RNA |
| 反应终产物 | cDNA | 经 PCR 扩增的 cDNA |
| 工作流程 |  |  |
| 包含的试剂 | 裂解→ 反转录 | 裂解 → 反转录 → qPCR |
| RT 引物 | 随机引物 + oligo(dT)引物 | Oligo(dT) 引物 |
| DNA 去除 | 是 (DNase 消化) | 是 (mRNA 富集) |
| 靶标数量 | 有限 | 全转录组 |
| 灵敏度 | + | +++ |
| 产量 | + | +++ |
| 应用 | RT-PCR ， RT-qPCR ，克隆 | 完整预扩增， RNA-Seq ， RT-qPCR |
| 立即订购 | 立即订购 |
SuperScript IV 单细胞/低起始量 cDNA 预扩增试剂盒中的 cDNA 合成预混液现在可以单独的 SuperScript IV 模板转换反转录预混液提供。
该预混液专为 cDNA 合成反应中的高模板转换效率而设计，包含 SuperScript IV 反转录酶， RNase 抑制剂和所有其他反转录反应组分，且采用方便操作的预混液形式。只需加入 RNA 模板、RT 引物和模板转换寡核苷酸（TSO）。该预混液兼容宽范围的总 RNA (2 pg - 4 μg) ，并随附提供裂解缓冲液，用于从完整哺乳动物细胞 (每份样本 1 – 1000 个细胞) 中直接合成 cDNA。
连同 SuperScript IV 模板转换反转录预混液，我们还可提供模板转换寡核苷酸（TSO）和捕获 Oligo (dT) 引物，两个引物均含有与预扩增引物互补的接头序列。
模板转换机制是如何工作的？
在模板转换机制中，反转录酶与 RNA 模板和 RT 引物双链结合，开始合成互补 DNA 链。当反转录酶到达 RNA 模板的 5' 端时，末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) 活性会在 cDNA 末端添加 1-3 个额外的核苷酸，从而能够结合模板转换寡核苷酸，并在生成的 cDNA 的 3' 端加入已知序列 (图1)。该 cDNA 可用于 PCR 扩增，通过 real-time PCR 进行基因表达分析，或作为 5' RACE、RNA-Seq 或第二链 cDNA 合成的模板。
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SuperScript IV 单细胞/低起始量 cDNA 预扩增试剂盒的优势
- 简化的实验流程，节约时间—单管实验方案，反应时间较短
- 出色的灵敏度—可从低至单个细胞或 2 pg 总 RNA 中轻松检测低丰度靶标
- 合成高质量 cDNA—均匀覆盖，可获得全长转录信息
- cDNA 整体预扩增—兼容下游 NGS 或 qPCR 分析
与同类产品的实验流程相比， SuperScript IV 单细胞 / 低起始量 cDNA 预扩增试剂盒实验流程所需的时间明显缩短 (图2)。
图 2. 与同类产品的实验流程比较。 SuperScript IV 单细胞 / 低起始量 cDNA 预扩增试剂盒与 Smart-seq3 Protocol V.3、NEBNext™ 和 Takara Smart-Seq v4 ™的实验流程和所需时间比较。
实验数据证明，SuperScript IV 单细胞/低起始量 cDNA 预扩增试剂盒可从低起始量 RNA 或单细胞中获得高得率的 cDNA。从低起始量 (2 pg) 通用人类参考 RNA (UHRR) 的 cDNA 得率几乎是 NEBNext™ Single Cell/Low Input cDNA Synthesis and Amplification Module 得率的两倍 （图3）。
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图 3.SuperScript IV PreAmp 试剂盒与 NEBNEXt ™预扩增试剂盒的 cDNA 得率比较。 与 NEBNext™ Single Cell/Low Input cDNA Synthesis and Amplification Module 相比， SuperScript IV 预扩增试剂盒可获得出色的 cDNA 得率。误差线代表至少五个平行重复实验之间的标准偏差。
SuperScript IV 预扩增试剂盒可均匀地预扩增转录物，以进行可靠的 RNA 测序。使用 SuperScript IV 预扩增试剂盒生成的 cDNA 制备的文库在归一化转录本差异方面具有较低的偏好性 (图 4)。
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图4.几种不同类型样本的归一化转录本覆盖。将单细胞 RNA 进行反转录，并使用推荐的 PCR 循环次数进行预扩增获得 cDNA。使用 Invitrogen Collibri ES DNA Library Prep Kit for Illumina™ Systems with UD indexes 制备用于 MiSeq ™测序系统的测序文库。
与同类产品的实验流程相比， SuperScript IV 单细胞 / 低起始量 cDNA 预扩增试剂盒实验流程所需的时间明显缩短 (图2)。
图 2. 与同类产品的实验流程比较。 SuperScript IV 单细胞 / 低起始量 cDNA 预扩增试剂盒与 Smart-seq3 Protocol V.3、NEBNext™ 和 Takara Smart-Seq v4 ™的实验流程和所需时间比较。
实验数据证明，SuperScript IV 单细胞/低起始量 cDNA 预扩增试剂盒可从低起始量 RNA 或单细胞中获得高得率的 cDNA。从低起始量 (2 pg) 通用人类参考 RNA (UHRR) 的 cDNA 得率几乎是 NEBNext™ Single Cell/Low Input cDNA Synthesis and Amplification Module 得率的两倍 （图3）。
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图 3.SuperScript IV PreAmp 试剂盒与 NEBNEXt ™预扩增试剂盒的 cDNA 得率比较。 与 NEBNext™ Single Cell/Low Input cDNA Synthesis and Amplification Module 相比， SuperScript IV 预扩增试剂盒可获得出色的 cDNA 得率。误差线代表至少五个平行重复实验之间的标准偏差。
SuperScript IV 预扩增试剂盒可均匀地预扩增转录物，以进行可靠的 RNA 测序。使用 SuperScript IV 预扩增试剂盒生成的 cDNA 制备的文库在归一化转录本差异方面具有较低的偏好性 (图 4)。
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图4.几种不同类型样本的归一化转录本覆盖。将单细胞 RNA 进行反转录，并使用推荐的 PCR 循环次数进行预扩增获得 cDNA。使用 Invitrogen Collibri ES DNA Library Prep Kit for Illumina™ Systems with UD indexes 制备用于 MiSeq ™测序系统的测序文库。
SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒的优势
- 简化实验流程，节约时间—在单个反应管中完成细胞裂解和反转录反应；整个实验流程可节省多达两小时的时间
- 方便—无需 RNA 提取步骤
- qPCR 兼容性—当与新上市的 PowerTrack SYBR Green Master Mix 搭配使用时，性能更出色
- 出色的灵敏度—可在1-10,000个细胞范围内轻松检测低丰度靶标
SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒使用简化的 cDNA 合成流程，无需提取 RNA（图5）。使用该方法所需的移液步骤更少，这有助于防止 RNA 损失和污染，从而节省时间和精力。此外， SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒具有出色的灵敏度，产量和线性度。
图 5.与传统的 cDNA 合成方法的实验流程比较。 SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒所用的实验方案可将从细胞到 cDNA 所需的时间缩短一半以上，大幅节省时间的关键与 RNA 分离纯化有关。
SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒对于多种细胞类型和样本量均具有高灵敏性。其针对高丰度 (ACTB) 、中等丰度 (PGK1) 和低丰度 (BCL2 ) 转录本均可获得更高的得率，优于市面上同类试剂盒 (图 6)。
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图 6.针对多种细胞转录本，使用不同直接反转录试剂盒的 cDNA 产量比较。分别使用 SuperScript IV CellsDirect 试剂盒和四种其他市售直接反转录试剂盒，从三种不同哺乳动物细胞类型 (Jurkat ， K562 和 iPSC) 样品中生成 cDNA。通过 qPCR 评估 44 种不同 RNA 转录本（代表了大范围的细胞丰度）的 cDNA 产量。SuperScript IV CellsDirect 试剂盒可获得较高的 cDNA 产量
对 1 - 10,000 个细胞范围的 HeLa S3 细胞进行系列梯度稀释，对于四个 mRNA 靶标 (ACTB、BCL2、PGK1、PPIA)，使用 SuperScript IV CellsDirect 试剂盒显示出较好的线性相关性 (图 7)。
图7.SuperScript IV CellsDirect 试剂盒在较大的细胞起始量范围内表现出较好的线性度，并拥有出色的 RNA 检测灵敏度。
SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒使用简化的 cDNA 合成流程，无需提取 RNA（图5）。使用该方法所需的移液步骤更少，这有助于防止 RNA 损失和污染，从而节省时间和精力。此外， SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒具有出色的灵敏度，产量和线性度。
图 5.与传统的 cDNA 合成方法的实验流程比较。 SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒所用的实验方案可将从细胞到 cDNA 所需的时间缩短一半以上，大幅节省时间的关键与 RNA 分离纯化有关。
SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒对于多种细胞类型和样本量均具有高灵敏性。其针对高丰度 (ACTB) 、中等丰度 (PGK1) 和低丰度 (BCL2 ) 转录本均可获得更高的得率，优于市面上同类试剂盒 (图 6)。
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图 6.针对多种细胞转录本，使用不同直接反转录试剂盒的 cDNA 产量比较。分别使用 SuperScript IV CellsDirect 试剂盒和四种其他市售直接反转录试剂盒，从三种不同哺乳动物细胞类型 (Jurkat ， K562 和 iPSC) 样品中生成 cDNA。通过 qPCR 评估 44 种不同 RNA 转录本（代表了大范围的细胞丰度）的 cDNA 产量。SuperScript IV CellsDirect 试剂盒可获得较高的 cDNA 产量
对 1 - 10,000 个细胞范围的 HeLa S3 细胞进行系列梯度稀释，对于四个 mRNA 靶标 (ACTB、BCL2、PGK1、PPIA)，使用 SuperScript IV CellsDirect 试剂盒显示出较好的线性相关性 (图 7)。
图7.SuperScript IV CellsDirect 试剂盒在较大的细胞起始量范围内表现出较好的线性度，并拥有出色的 RNA 检测灵敏度。
Cells-to-cDNA 试剂盒
SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒
SuperScript IV 单细胞/低起始量 cDNA 预扩增试剂盒
SuperScript IV 模板转换反转录预混液
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