图 1.CRISPR gRNA 和 Cas9 蛋白。
革命性的 CRISPR-Cas9 技术正在不断革新基因组编辑领域。CRISPR-Cas9 系统能够实现高度灵活性和特异性靶向性，可进行修饰和重定向，也已成为干细胞工程、基因治疗、组织和动物疾病模型以及设计抗病转基因植物等广泛应用中的强大基因组编辑工具。赛默飞世尔科技的专家已整合该一系列资源，您可以放心地开始基因编辑或持续改进您的研究。
什么是 CRISPR 技术？
成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 系统是一种简单快速有效的方法，可直接在细胞中对基因序列进行更改。CRISPR-Cas9 系统源自简单细菌免疫系统的组分，能够在多种细胞中进行靶向基因切割和基因编辑。
由于 CRISPR-Cas9 系统中的核酸内切酶切割特异性由 RNA 序列引导，因此通过对向导 RNA (gRNA) 序列进行工程改造，并将其与 Cas9 核酸内切酶一起递送至靶细胞内后，几乎可以对任何基因组位点进行编辑。
CRISPR 是如何工作的？
CRISPR-Cas9 系统由非编码短 gRNA 和 Cas9 核酸酶组成（图 1）。gRNA 有两个分子组分：一个靶点特异性 CRISPR RNA (crRNA) 和一个辅助性的反式激活 crRNA (tracrRNA)。gRNA 单元将 Cas9 蛋白引导至特定基因组位点，Cas9 核酸酶在该位点诱导特定基因组靶序列的双链断裂（图 2）。
图 2.CRISPR-Cas9 系统。
在细菌中，CRISPR 位点由一系列重复序列组成，这些重复序列被 30bp 左右长度的外源 DNA 间隔开来，这些外源 DNA 称为间隔区序列（spacer）。重复-间隔的阵列被转录为一条较长的前体RNA，其中的重复序列被加工并生成定义了靶标序列的短小 crRNA（也称为前间区序列（protospacer）） - 靶序列据此被 Cas9 核酸酶切割。之后人们将CRISPR间隔区序列作为在DNA水平识别和沉默外源基因元件的工具。
重要的是，紧邻靶区域 3'端下游的称为原型间隔区相邻基序 (PAM) 序列的特定三核苷酸序列必须存在才能发生切割。该 PAM 序列 (Cas9 的 NGG) 存在于靶 DNA 中，但不存在于靶向该 DNA 的 gRNA 中。
使用 CRISPR-Cas9 切割 DNA 后，双链断裂可以通过两种细胞自然修复机制之一进行修复（图 3）。
- 在不存在修复模板的情况下，非同源末端连接(NHEJ) 过程会导致 gRNA 定义的断裂周围有不同插入或缺失（插入缺失）的异质细胞群。可利用该过程在特定序列周围生成有随机缺失的细胞系，从而获得功能性敲除。
- 或者，如果提供了修复模板，则可以通过无差错的同源定向修复 (HDR) 机制，在基因组内的特定位点引入用户定义的序列变化。该过程可用于过表达新基因，建立疾病相关细胞模型或用可报告的基团标记内源性基因。
图 3.CRISPR-Cas9 双链断裂和修复通路。切割反应同时发生于两条链中靶序列的3’端 PAM 序列上游 NGG 的 3 个碱基对上。
使用 CRISPR-Cas9基因编辑技术的成功秘诀
如果选择 CRISPR-Cas9 进行基因编辑工作流程，请确保了解使用本系统时可能会影响基因组编辑效率的因素。重要的是要考虑您的实验设计，包括用于切割的核酸酶形式和 gRNA，将分子最有效地递送到细胞中的转染方法以及检测基因编辑以适当验证结果所需的检测。
| 设计 和构建 | 递送 | 检测 和验证 |
|---|---|---|
设计实验时的关键注意事项 ：
| 进行细胞转染时的关键考虑因素 ：
| 检测编辑时的主要考虑因素 ：
|
可用的 CRISPR 技术
赛默飞世尔科技提供一整套基因组编辑试剂（图 4）。我们会根据您的应用和细胞类型，为这些基因编辑解决方案匹配最佳的细胞培养试剂、递送方法以及分析工具。
图 4.可用的 CRISPR-Cas9 核酸酶和 gRNA 形式。
CRISPR 特色工具和资源
Invitrogen TrueDesign 基因组编辑软件是一款免费的基因编辑设计工具，可让您轻松设计、选择和订购试剂，进行准确和精确的基因编辑实验。
基因编辑资源和支持
资源
支持
仅供科研使用，不可用于诊断目的。
仅供科研使用，不可用于诊断目的。