TrueCut Cas9 蛋白

图 1.使用 TrueGuide 化学合成 gRNAs 敲除 T 细胞受体。使用 Invitrogen Dynabeads 磁珠（货号：11344D和11141D）分离并活化人T 细胞，然后使用Invitrogen Neon转染系统以及TrueCut Cas9 蛋白 v2 和靶向T细胞受体 α（TRAC）或β（TRBC）区域的 TrueGuide 化学合成 gRNA 转染细胞。转染后，使用 InvitrogenGeneArt Cleavage Detection分析 (A) 检测编辑效率，或者采用T细胞受体特异性 PE (B) 偶联抗体对细胞进行染色后，使用 Invitrogen Attune NxT 流式细胞仪测定T细胞受体阴性 (TCR –) 细胞的比例 (B)。

图 2.癌细胞中稳健的编辑效率。使用 TrueCut Cas9 Protein v2（货号：A36497 ）和TrueGuide 化学合成 gRNA 的复合物对多种癌细胞系和基因靶点进行测试，以确定该复合物的编辑效率。在这里，使用Lipofectamine CRISPRMAX Cas9 转染试剂（货号：CMAX00003）将 Cas9 RNP 复合物递送到三种不同的癌细胞系中，在转染后72小时，收获细胞并使用 GeneArt Genomic Cleavage检测试剂盒 (GCD)  或 Ion Torrent 新一代测序仪(NGS) 检测编辑效率。Panel ( A) A549，一种上皮（肺癌）细胞、(B) U2OS, 骨肉瘤细胞株系、(C) MDA-MB231，上皮（乳腺）腺癌细胞系

图 3. 在原代 T 细胞中使用 TrueCut HiFi Cas9 显著降低脱靶效应。(A) 21 个靶向 CD52、TRAC、TRBC 和 PD1 基因的 gRNAs 与 wt-Cas9、Supplier I 高保真 Cas9 和 TrueCut HiFi Cas9 共转染。基因名下列出的数字是 gRNAs 的编号。脱靶/在靶比例是根据单个脱靶的 RPM 除以相应的在靶 RPM 计算得出的。红点代表“在靶切割”，设置为 100%。灰点代表“脱靶切割”，是根据相应的脱靶/在靶比例绘制的。灰点出现在红点上方表示，“脱靶”的 reads 多于“在靶”的 reads。

图 4. 在 iPSCs 中使用 TrueCut HiFi Cas9 显著提高靶向编辑效率。两个 gRNAs 靶向镰状细胞贫血症相关的血红蛋白 β 亚单位基因 (HBB) 中的 SNP，另一个 gRNA 靶向常用于脱靶研究的 HEK4 位点，分别与 TrueCut Cas9 v2 (货号 A36497) 和 TrueCut HiFi Cas9 (货号 A50575) 共转染到 iPSCs中。图中列出的是在靶和脱靶编辑的 RPM 柱状图。

图 4 .  使用 TrueCut HiFi Cas9 时，人类原代T细胞中卓越的低脱靶效应使用 Neon电穿孔转染系统，将 21 个靶向四种基因（CD52、TRAC、TRBC和PD1）的 gRNAs 与 Truecut Cas9 v2（货号：A36497），TrueCut HiFi Cas9（货号：A50575）和竞争对手的HiFi Cas9 共转染。红点代表在靶切割并标准化为 100%。灰点代表脱靶切割，根据对应的脱靶/在靶比例绘制，该比例代表每个脱靶编辑事件的风险概率。

图 5.  使用TrueCut HiFi Cas9 保持高靶向编辑效率。在原代T细胞中评估了使用 gRNAs（靶向治疗基因CD52、TRAC、TRBC、PD1）的靶向编辑活性，包括 indel 和 HDR。并使用 Ion Torrent NGS 的靶向扩增子测序技术进行筛选。与 TrueCut Cas9 v2（标准化为100%）相比，TrueCut HiFi Cas9 相对于 TrueCut Cas9 Protein v2在 T 细胞中保持了85%以上的靶向编辑效率。

图 3.Invitrogen CRISPR 基因组编辑工具始终优于其他品牌的产品。用 TrueCut Cas9 Protein v2 和相应的TrueGuide 化学合成 gRNAs对多个基因靶点进行基因组编辑。使用经过优化的转染方案和 Invitrogen Lipofectamine CRISPRMAX转染试剂在两种细胞系中实现递送，即 (A) A549 人肺癌细胞系和 (B) MDA-MB231人乳腺癌细胞系。这些图表比较了使用其他供应商的产品和方案进行相同实验的结果。使用 Invitrogen 系统，困难靶点（PRKCG-T1和CMPK1-T1）的编辑效率得到提高，对于困难靶点的编辑效率始终高于其他供应商的产品和方案。

Figure 8. TrueCut HiFi Cas9 reduced 80% more off-target events with high risk probability (>10%) compared to the competition in T-cells.. 21 gRNAs targeting four therapeutic genes (CD52, TRAC, TRBC, and PD1) were co-transfected with TrueCut Cas9 v2 (Cat. No. A36497), TrueCut HiFi Cas9 (Cat. No. A50575), and other supplier's HiFi Cas9 using the Neon Transfection System. Total number of off-target events grouped according to risk probability.

图 6.各细胞类型中的编辑效率始终如一TrueCut Cas9 Protein v2 已经在多种细胞类型中使用脂质介导的递送或Neon 电穿孔转染系统进行了测试。在这里，我们展示了四种代表性细胞类型中的高效编辑，包括贴壁细胞系（A549、HepG2），悬浮细胞 (THP1) 和原代疫细胞（原代人类 T 细胞）。用 TrueCut Cas9 Protein v2 (货号：A36497）和 TrueGuide Positive Control crRNA（货号：A35517）以及TrueGuide tracrRNA（货号：A35506）对细胞系进行转染。