利用蛋白水解靶向嵌合体进行靶向蛋白质降解

靶向蛋白质降解 (TPD) 是一种新的治疗方法，用于阻断细胞的降解途径，诱导特异蛋白质的降解。蛋白质降解是一个严格调控的细胞过程，消除功能失调的蛋白质，可调节细胞中蛋白质的表达水平，对于细胞内稳态至关重要。

蛋白水解靶向嵌合体 (PROTACs®) 是小分子异双功能降解剂，通过将 E3 泛素连接酶连接到目标靶蛋白 (POI)，促进其传输到蛋白酶体进行降解，从而辅助细胞泛素-蛋白酶体降解途径 (UPP)。虽然 PROTAC 的大部分作用都集中在药物研发上，但在基础生物学研究中，PROTAC 也是一个有用的工具，可靶向融合标记的 POI 进行降解，以便在无需基因操纵的情况下探究细胞途径。

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2001 年，Craig Crews 和 Raymond Deshaies 团队提出了 PROTAC 的治疗应用概念，并已用于不同亚细胞定位的多个靶点[1,2]。利用自然细胞过程进行蛋白质降解以进行潜在治疗的概念最初是通过病毒和植物研究形成的。

已知病毒通过细胞自身的机制，利用人类泛素-蛋白酶体途径 (UPP)实现高效复制和生存。例如，人乳头瘤病毒 16 型 (HPV-16) 利用 E6 蛋白招募人 E3 连接酶和泛素化晚期 p53，导致其降解[1]。在植物中，除了蛋白质外，小分子也能够进行 UPP 介导的蛋白质降解[1]。激素生长素（吲哚-3-乙酸；IAA）可影响参与植物发育的 Aux/IAA 族系转录抑制因子的降解。这些早期研究突出了使用 E3 连接酶有意开发和指导靶向蛋白质降解的可能性。最新 PROTAC 专为小分子结构设计，旨在降解一系列靶蛋白[1, 3]。在过去的二十年中，越来越多的证据表明，PROTAC 具有强大的治疗潜力。研究已经从基础的细胞研究转向更多的动物和体内疾病模型，近期甚至拓展至临床试验阶段[1,4]。

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许多小分子药物通过与靶蛋白结合发挥作用，导致功能抑制。由于这些小分子抑制剂需要与蛋白质结合以保持活性，因此可能需要高浓度的药物，导致意外脱靶效应[1,2]。小分子抑制剂的另一个重要限制是需要与靶蛋白的活性或变构位点结合，可能很难结合到一些疾病相关的蛋白。

PROTAC 是异双功能分子，由两个通过连接子[1]连接的配体组成。其中一个配体负责吸收和结合靶标 POI，而另一个配体结合 E3 泛素连接酶。PROTAC 分子将 POI 与 E3 连接酶连接，形成三元配合物，诱导 E3 连接酶将靶蛋白泛素化并启动降解过程[1,5]。PROTAC 利用 UPP 之后的蛋白质水解机制，其中细胞内蛋白质被自然降解，成为维持细胞的一部分。在蛋白质引入到蛋白酶体后，PROTAC 经过重新加工，并得到有效回收，用于靶蛋白的其他拷贝。POI 被蛋白酶体内的 UPP 降解，形成氨基酸和多肽底物，供未来细胞使用（图 1）。

图 1.泛素-蛋白酶体途径中的 PROTAC。
 

与传统的小分子抑制剂相比，PROTAC 在 TPD 应用方面有许多优势。首先，PROTAC 通过利用传统上由于缺乏明确的结合袋而被认为无成药性的靶点来扩大可靶向蛋白的可及性，抑制脱靶效应。其次，虽然小分子抑制剂对一种酶的特定催化功能起作用，但许多酶在支架构成中具有双重作用，在疾病中发挥关键作用。PROTAC 不改变酶的活性，而是直接降解 POI，从而消除蛋白质的所有功能。再次，PROTAC 具有催化作用，除泛素化过程之外，不需要保持结合状态。POI 泛素化后，PROTAC 就会解离，并可回收用于多轮的泛素化/降解[1,4]。这种机制能力使药物能够在较低剂量下使用，从而减少脱靶效应和耐药性。这一领域还有大约 600 种泛素连接酶有待研究，在开发治疗多种不同疾病方面有着巨大的潜力[1]。

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为了评估靶向蛋白质降解的功能和效率，需要灵敏、可靠、通量高的解决方案。从 E3 连接酶结合和三元络合物形成到泛素化和降解，在整个工作流程中有多个步骤可以使用各种工具和科学应用程序来监测 TPD 效率（图 2）。

图 2.评估 PROTAC 效率的常用检测法。
 

为了形成有效工作的降解剂，E3 连接酶结合基序必须通过精心设计的连接子连接到 POI 配体。PROTAC 和 E3 连接酶与 POI 一起形成三元络合物。为了确定蛋白质降解剂 (PROTAC) 上是否存在必要的 E3 连接酶结合基序，建议利用结合检测法，如利用荧光偏振或时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET)技术。

PROTAC 是异双功能分子，用于招募 E3 连接酶以降解具有治疗意义的蛋白质，这是蛋白质降解过程中必不可少的一步。三元络合物的形成触发了 UPP 对 POI 的泛素化。

评估三元络合物形成的最重要的方法之一是进行邻近检测，如 TR-FRET 或交联质谱[6]。TR-FRET 利用长寿命荧光团和积分时间荧光对分子结合和分离进行定量分析。这一操作可用于研究 PROTAC 与其 POI 之间的相互作用[6]。用于蛋白质与蛋白质之间相互作用研究的交联质谱可以通过帮助识别蛋白复合体实现相互作用区域的可视化。

为了评估蛋白质是否降解，必须要确认蛋白质是否经过泛素化。评估蛋白质泛素化的方法有很多，如 TR-FRET、蛋白质印迹、ELISA、蛋白质质谱和蛋白质分离检测。LanthaScreen TR-FRET 检测 提供高通量筛选试剂，监测在动力学或终点读数方面的 PROTAC 诱导的泛素化情况。多泛素化蛋白可以使用高结合亲和树脂从细胞裂解液中分离出来。在这种情况下，可使用泛素富集试剂盒分离及分析这些蛋白质。进行蛋白质谱分析也可以是识别修饰前和修饰后蛋白质的一个重要工具。

为了确定 POI 是否进行了降解，可以通过蛋白质印迹或进行免疫测定来评估蛋白的表达水平。通过串联质谱和串联质谱标记 (TMT) 系统可以实现大规模蛋白质降解分析，这是确认 POI 降解和筛选 PROTAC 对其他蛋白质的脱靶效应的强大工具。在较小的范围内，可利用单细胞分析。此外，TR-FRET 检测可以确定 PROTAC 和各自 POI 之间缺乏相互作用，以评估降解情况。

在细胞毒性方面，已有研究表明，PROTAC 诱导的肿瘤蛋白质降解可通过细胞凋亡导致细胞死亡[7]。靶向蛋白质降解后的细胞健康状况可以通过各种细胞活力和功能检测来评估，包括细胞凋亡检测和细胞增殖检测。流式细胞术、微孔板检测和高内涵筛选也可用于评估细胞活性，并提供基于 PROTAC 分子治疗后细胞的生理健康信息。

随着 PROTAC 的成功，更多研究开始针对不依赖 UPP 进行蛋白质降解的各种异双功能分子。例如，自噬靶向嵌合体 (AUTAC) 通过标记 POI 的鸟嘌呤衍生物发挥作用，使其通过自噬机制降解。自噬连接化合物 (ATTEC) 将与自噬蛋白 LC3（微管相关蛋白质 1 轻链 3a）结合的配体连接到 POI，通过将 POI 直接连接到自噬体而绕过 UPP[1]。分子胶是另一种蛋白质降解剂，形成一个重要的治疗类别。虽然分子胶不像 PROTAC 那样具有异双功能，但其在 E3 连接酶和新底物之间保持稳定或创建新的结合位点，从而通过 UPP 实现泛素化和降解[1,8]。虽然 PROTAC 和分子胶继续被开发用于靶向细胞内蛋白质，但占蛋白质组 [1] 40% 的细胞因子和生长因子等细胞外蛋白无法让 UPP 接近进行降解，需要使用 TPD 的替代方法。

溶酶体靶向嵌合体 (LYTAC) 的工作原理是将膜结合的 POI 与溶酶体穿梭受体的胞外结构域结合，将 POI 内化到溶酶体中进行降解[1]。另一方面，基于抗体的 PROTAC (AbTAC) 是双特异性抗体，其将膜结合连接酶吸收到膜结合 POI 上，通过溶酶体降解途径进行降解。这些靶向蛋白质降解的新方法继续用可靠的治疗成果推动这一领域的发展。

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PROTAC® 是 Arvinas Operations, Inc. 的注册商标。