Note: This protocol is intended for use with the specific products mentioned within it. Substituting different products is not recommended.

介绍

BrdU 染色试剂盒包含通过流式细胞术来鉴定并检测细胞增殖所需的试剂和缓冲液。用 5-溴-2’-脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）培养处于分裂周期的细胞。BrdU 是胸苷的一种合成胸腺嘧啶类似物，在有丝分裂的 S 期会掺入到新合成的基因组 DNA 中。随后进行 DNA 变性， 通过细胞染色来确定 BrdU 插入情况以及任何其他细胞表面和/或感兴趣的胞内目标物。

一般注意事项

请小心处理。产品含有甲醛。

如有需要，可单独购买 BrdU 单克隆荧光抗体（克隆号BU20A）。

方案

提供的材料

  • BrdU（32.5 mM，10 mg/mL）：5 x 1 mL 无菌小瓶；储存温度不超过 -70°C。避免反复冻融。应在无菌条件下打开小瓶。
  • DNase I（1 mg/mL；0.3 mg/小瓶）：10 x 0.3 mL 小瓶；储存温度不超过 -70°C。每个小瓶可用于处理 10 个样本。避免反复冻融。
  • 抗 BrdU 抗体（克隆号BU20A），荧光染料偶联：1小管能做100个测试；在 2-8°C 下储存。
  • BrdU 染色浓缩缓冲液（4X）：1 x 30 mL 瓶子；在 2-8°C 下储存。该缓冲液含有甲醛。请适当处理。
  • 固定/破膜稀释液：1 x 100 mL 瓶子；在 2-8°C 下储存。

需要的其他材料

  • 无菌 1X PBS
  • 流式细胞术染色缓冲液（货号：00-4222）
  • 12 x 75 mm 圆底试管
  • 可选：
    • 荧光直标一抗
    • Fixable Viability Dye (FVD) eFluor™ 450（货号：65-0863）、eFluor™ 660（货号：65-0864）、eFluor™ 780（货号：65-0865）、eFluor™ 506（货号：65-0866）、eFluor™ 520（货号：65-0867）和 eFluor™ 455UV（货号：65-0868）
  • 固定/破膜稀释液：1 x 100 mL 瓶子；在 2-8°C 下储存。

备注： BrdU 和Fixable Viability Dye 标记细胞后（但在固定前），可以加入抗体用于表面标记物染色。或者，如果已知某抗体能够识别用甲醛固定的表位，则可以同时加入该抗体和 BrdU 抗体。

制备BrdU 染色缓冲工作液

  • 通过用固定/破膜稀释液（3 份）稀释 BrdU 染色浓缩缓冲液（1 份）来制备新鲜的 1X BrdU 染色缓冲工作液。轻轻上下颠倒混匀，请勿涡旋。每个样本需要 1 mL 的 1X BrdU 染色缓冲工作液。因为缓冲液含有甲醛，务必小心并妥善处理。
实验步骤

第 1 步：用10µM BrdU体外标记105-108 个分裂的细胞，37℃下标记45分钟。

  1. 在无菌条件下，在冰上溶解 BrdU 并用无菌 1X PBS 稀释，使工作浓度达到 1 mM。
  2. 向每个样本中加入 10 µM BrdU。（例如，直接加入 10 µL 的 1 mM BrdU到每毫升培养基中。）
  3. 细胞培养的时间要足够长，以保证BrdU 掺入。具体时间取决于培养条件（例如所用刺激剂）和细胞增殖的动力学。因此，需要根据经验确定培养时间。培养后，收集细胞。
  4. 加入2 mL染色缓冲液(如果继续操作步骤2，则加入无叠氮的PBS)洗涤细胞，然后室温300-400 xg离心5分钟。去掉上清液。

第 2 步：[可选]细胞固定前用 fixable viability dye（FVD）标记死细胞。

注意：在打开可 fixable viability dye小瓶前，应平衡至室温。FVD必须与不含叠氮化物的 PBS 配合使用。为保证细胞染色的一致性，染色用量不得低于 0.5 mL。更多相关信息，请参阅我们的网站——最佳方案“活性染色方案，方案C：用 Fixable Viability eFluor™ Dyes”对死细胞进行染色”。（如果不使用 FVD，则前往操作步骤 3。）

  1. 如步骤 1d 中所述，用 2 mL 不含叠氮化物的 PBS 再清洗一次细胞。
  2. 用不含叠氮化物的 PBS 将细胞重悬，使其浓度达到 1-10x106 个细胞/mL。
  3. 向每 1 mL 的细胞中加入 1 μL 的Fixable Viability Dye ，立即涡旋。
  4. 然后在 2-8°C 下避光孵育 30 分钟。
  5. 通步骤1，用染色缓冲液清洗细胞 1-2 次。
  6. 用染色缓冲液将细胞重悬，使浓度达到 1-10x106 个细胞/mL。

第 3 步: [可选]对细胞表面抗原进行染色。

注意：更多相关信息，请参阅我们的网站——最佳方案“对细胞表面抗原进行染色用于流式细胞术分析”。（如果不需要检测细胞表面抗原，或者已知抗体能够识别甲醛固定过的表位，则前往操作步骤 4。）

  1. 将 50 μL 的细胞悬液平均分到各个试管或微孔中。可以根据经验确定细胞数量，但范围应在 105-108个细胞/每个测试。
  2. 往适量的染色缓冲液中加入推荐量（请参阅各款产品的技术数据表）的各种荧光一抗，使最终反应体积约为 100 μL。（例如，向 50 μL 的细胞中加入 50 μL 的抗体混合物。）轻轻混匀。
  3. 在 2-8°C 下避光孵育 30 分钟以上。
  4. 如步骤 1d 中所述，用染色缓冲液洗涤细胞两次。

第 4 步：固定细胞，用抗 BrdU 进行胞内染色。

  1. 将 DNase I 溶液在冰上溶解。溶解后，向 700 µL 的染色缓冲液中加入 300 µL 的 DNase I 溶液，轻轻混匀，DNase I 工作液制备完毕。然后置于冰上，留待步骤 4f 使用。
  2. 如果在步骤 2 或 3 中未对细胞进行染色，则将 100 μL 的细胞悬液平均分到每个试管中。可以根据经验确定细胞数量，但范围应在 105-108个细胞/每个测试。
  3. 涡旋步骤 2f、3d 或 4b 处理过的细胞，保证细胞充分重悬。在加入新鲜配制的 1X BrdU 染色缓冲工作液之前，务必完成上述重悬步骤。
  4. 加入 1 mL 的新鲜配制的 1X BrdU 染色缓冲工作液，轻轻混匀。在室温下避光孵育 15 分钟。可以适当延长孵育时间（不超过 14 小时），但应根据经验确定每种细胞的培养时间。
  5. 如步骤 1d 中所述，用染色缓冲液清洗细胞两次。
  6. 向每个样本中加入 100 µL 的 DNase I 工作溶液（在步骤 4a 中制备）。在 37°C 下避光孵育 1 小时。
  7. 如步骤 1d 中所述，用染色缓冲液清洗细胞两次。
  8. 向每个样本加入 5 µL 的抗 BrdU 荧光抗体。然后混匀，在室温下避光孵育20-30 分钟。
    注意：针对在步骤 3 中未经染色处理的细胞内抗原或表面抗原，可在此步骤中加入抗体。在此步骤中用于表面染色的抗体必须能够识别固定表位。如果这个抗体只能识别天然表位，或者有关于此的信息是未知的，我们建议在步骤 3 中进行表面染色。
  9. 如步骤 1d 中所述，用染色缓冲液清洗细胞两次。

第 5 步：流式细胞仪读取数据。