传统的短发夹 RNA (shRNA) 序列在含有 Pol III 启动子的载体的细胞核中转录。shRNA 含有用环连接的靶基因的正义和反义序列，从细胞核转运至细胞质中，在细胞质中，酶（核酸酶）将其处理成小/短干扰 RNA (siRNA)。此时，它继续通过 RNA 干扰通路靶向互补 mRNA 并最终敲低蛋白表达。
载体设计和构建
表达 shRNA 的载体通过设计将正义-环-反义序列编码为目标基因的短双链 DNA 寡核苷酸而生成。此序列的两侧将有一个四核苷酸突出端，它与入门载体结构体兼容并且可以通过短暂的台式连接反应克隆成 pENTR/H1/TO 或 pENTR/U6 入门载体。
入门载体包含 U6 Pol III 型启动子和 Pol III 终止子序列。一旦双链寡核苷酸序列被克隆成载体，会创建表达 shRNA 的 RNAi 盒。
shRNA 克隆成诱导型和组成型 BLOCK-iT 入门载体
表达 shRNA 的载体通过设计含针对靶标的正义-环-反义序列的短双链 DNA 寡核苷酸而生成。序列末端有 4-核苷酸突出端，它通过短暂的台式反应连接到 pENTR/H1/TO 或 pENTR/U6 入门载体。入门载体含有带两个四环素操纵子位点的 H1 启动子或 U6 Pol III 型启动子和 Pol III 终止子序列，这两个位点在 TATA 区域的侧翼。将双链寡核苷酸序列克隆成载体会创建表达 shRNA 的 RNAi 盒。
稳定的 shRNA 表达
将您的 shRNA 盒转染成一个或多个 BLOCK-iT DEST 载体以便在哺乳动物细胞中高效递送和表达 shRNA。每个目的 (DEST) 载体都使用 Gateway 技术设计以便在仅一小时内将 RNAi 盒从 BLOCK-iT pENTR 载体轻松转染成 BLOCK-iT DEST 载体。您可根据您的细胞类型和选择需求选择要使用的载体。在几乎任何哺乳动物细胞类型内递送，包括难转染的原代细胞甚至不分裂细胞并可选择 BLOCK-iT 病毒载体：
- pLenti6/BLOCK-iT-DEST：使用杀稻瘟菌标记物的慢病毒载体，可快速、高效地选择组成型 shRNA 表达
- pAd/BLOCK-iT-DEST：用于高效、轻松生成腺病毒载体，无需穿梭载体或其他繁琐的方法
BLOCK-iT shRNA 载体
| 载体类型 | 属性 | 应用 | 优点 | 产品 |
|---|---|---|---|---|
| BLOCK-iT 入门载体 | 载体： pENTR/U6 系统：质粒 选择：无 启动子：U6 | 瞬时 可转染 哺乳动物 细胞中的 RNAi | -用于 shRNA 表达的组成型启动子 -5分钟完成 shRNA 盒的台式克隆 -轻松将 shRNA 盒转染成其他 BLOCK-iT DEST 载体 -经济高效、易于再生的载体 | BLOCK-iT U6 RNAi 入门载体 试剂盒 (K494500) |
| 病毒 BLOCK-iT DEST 载体 | 载体： pLenti4/BLOCK-iT -DEST 系统：慢病毒 选择：Zeocin 启动子：无 | 几乎任何类型的哺乳动物细胞或动物模型中稳定的 RNAi | - 通过高效慢病毒整合有效、长期地表达 shRNA - 可重现递送到原代细胞和不分裂细胞类型 - 一小时轻松重组 H1/TO 或 U6 shRNA 盒 | BLOCK-iT 慢病毒 RNAi Zeo Gateway 载体试剂盒 (V48820) |
| 载体： pLenti6 /BLOCK-iT -DEST 系统：慢病毒 选择：杀稻瘟菌 启动子：无 | 慢病毒 | - 通过高效慢病毒整合有效、长期地表达 shRNA - 可重现递送到原代细胞和不分裂细胞类型 - 一小时轻松重组 H1/TO 或 U6 shRNA 盒 -通过有效杀稻瘟菌选择试剂快速选择 | BLOCK-iT 慢病毒 RNAi Gateway 载体试剂盒 (K494300) BLOCK-iT 慢病毒 RNAi 表达 系统 (K494400) | |
| 载体： pAd/BLOCK-iT -DEST 系统：腺病毒 选择：无 启动子：无 | 腺病毒 | - 有效、可重现地递送到几乎任何类型的哺乳动物细胞 - 适合大量实验或动物工作的高滴定病毒储备 - 一小时轻松重组 H1/TO 或 U6 shRNA 盒，无需使用穿梭载体或其他繁琐的方法 | BLOCK-iT 腺病毒 RNAi 表达系统 (K494100) | |
| 支持载体 | 载体： pLenti6/TR 系统：慢病毒 选择：杀稻瘟菌 启动子：CMV | 生成组成型表达四环素抑制因子 (TR) 的稳定细胞系 | - 在几乎任何类型的哺乳动物细胞中高效递送、长期稳定地整合，还递送慢病毒 - 在使用诱导系统时，CMV 启动子用于高水平表达四环素抑制因子蛋白以实现极低的基础 shRNA 表达 - 使用有效杀稻瘟菌素选择试剂快速选择表达四环素抑制因子蛋白的细胞 | pLenti6/TR 载体试剂盒 (V48020) |
| 载体： pcDNA6/TR 系统：质粒 选择：杀稻瘟菌 启动子：CMV | 质粒 | - 在使用诱导系统时，CMV 启动子用于高水平表达四环素抑制因子蛋白以实现极低的基础 shRNA 表达 - 使用有效杀稻瘟菌素选择试剂快速选择表达四环素抑制因子蛋白的细胞 | pcDNA 6/TR (V1025-20) |
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