 | FIX & PERM细胞固定/透化试剂盒可以温和地进行细胞固定与破膜，同时保证细胞形态散射特性不受影响，使研究人员可以准确地确定之前无法检测的胞内标记，例如细胞质酶或细胞核酶、肿瘤蛋白、细胞因子和免疫球蛋白等。
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本页内容
- 关于FIX & PERM细胞固定/透化试剂盒
- 表面标记物和胞内蛋白
- 实验方案
- 参考文献
- 订购信息
FIX & PERM细胞固定/透化试剂盒
- 可大多数细胞抗原分析相兼容
- 不影响细胞的形态学散射特性
- 降低背景染色
- 经过验证的实验方案
FIX & PERM细胞固定/透化试剂盒包括搭配好的固定剂（A液）和破膜剂（B液），能够在同一细胞群中同时实现细胞内和细胞表面抗原分析（图1）。该处理便于抗体进入细胞内结构，同时保证细胞形态散射特性不受影响，独特的配方可降低背景染色，且使用时可同时加入破膜剂和荧光标记的抗体。固定剂和破膜剂也可以单独使用。
FIX & PERM试剂盒可适用于各种生物样本（血液、骨髓等）来源的正常和病变细胞群的流式细胞分析（图2）。
图1 - FIX & PERM细胞固定/透化试剂盒同时应用于细胞表面抗原与胞内抗原的染色。 采用豆蔻酰佛波醇乙酯（PMA）和离子霉素，在brefeldin A存在的条件下刺激C57BL / 6脾细胞5小时，对照组不刺激。然后采用 荧光素 (FITC) 标记的抗鼠CD4抗体对细胞表面进行染色，之后用FIX & PERM细胞固定/透化试剂盒对样品进行固定和破膜。 在破膜过程中使用 PE-Cy7 tandem标记的抗鼠γ-干扰素 (γ-IFN) 抗体 和 Pacific Blue™标记的抗鼠肿瘤坏死因子α (TNF-α) 抗体进行细胞内染色。. 使用Attune声波聚焦流式细胞仪（蓝/紫）分析收集数据，通过488nm激发光和530/30nm通道检测FITC荧光，通过640nm通道检测PE-Cy7 tandem荧光，通过405 nm激发光和450/40 nm通道检测Pacific Blue™荧光。 (上图) 对淋巴细胞设门，对在brefeldin A PMA和离子霉素对C57BL / 6脾细胞进行刺激（左图）或不刺激 (右图) 的鼠脾细胞进行γ-IFN和TNF-α抗体共染色。（下图）按上述方法刺激后，CD4+ T细胞中TNF-α（左图）和γ-IFN（右图）的表达。
图2 - 全血样品免疫表型。 对保存两天的全血用氯化铵裂解，首先用CD13-APC偶联物对细胞染色，然后洗涤细胞，用 LIVE/DEAD Fixable Near-IR dead cell stain, 试剂盒染色，洗涤，用FIX & PERM A液固定；再洗涤，然后使用FIX & PERM B液进行破膜，用MPO-FITC偶联物染色，洗涤，之后使用BD™ LSRII流式细胞仪分析细胞。将活细胞设门（通常建议这样操作以去除死细胞），然后再进一步设门以获得最准确的结果。
FIX & PERM细胞固定/透化试剂盒可以高效检测广泛的胞内蛋白与表面标记物，包括但不限于:
| 溶酶体蛋白 | Elastase, lactoferrin, lysozyme, myeloperoxidase, proteinase-3 |
| 细胞质CD分子 | CD3, CD13, CD22, CD62P, CD63, CD68, CD79a |
| 核增殖标记 | BrdU, Ki-67, PCNA, 核酶, TdT |
| 肿瘤蛋白 | Bcl-2, c-Myc, p53, HIV 抗原, p24 |
| 细胞因子和趋化因子（人） | IFN-γ, TNF-α, IL1-β, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IL-16, RANTES |
| 细胞因子和趋化因子（鼠） | IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, IL-16 |
| 免疫球蛋白（人） | IgA, IgG, IgD, IgM, kappa, lambda |
| 免疫球蛋白（鼠） | IgG, IgM |
| 其它分子 | ZAP-70 (zeta相关蛋白70), MHC class II, phosphotyrosine, thrombospondin, cyclins, 转染细胞, MDR (多抗药性) |
FIX & PERM细胞固定/透化试剂盒适用于所有市面上流式细胞仪。对于大多数抗原来说，该胞内染色标准程序都能获得最优结果。还有一种使用预冷的无水甲醇的改进方法可在分析某些细胞周期抗原时获得更好的结果，如使用FITC标记的抗体分析Ki-67和PCNA等，但这种改进方法不推荐用于RPE偶联抗体的检测。下列染色实验方案可直接用于待分析的悬浮细胞。
在使用FIX & PERM细胞固定/透化试剂前，请勿使用其他细胞裂解液.
- 对于每个待分析的样品，直接加入适量的相应的细胞表面标记物偶联抗体或合适的同型对照，调整体积至5ml，12 x 75 mm管.
- 吸取100ul全血或样本细胞（刺激后的PBMCs、骨髓、脾、胸腺），等效于1 x 106个细胞，加入试管中.
- 轻轻涡旋混匀，室温下避光孵育15分钟.
- 加入100ul A液（固定剂），室温下避光孵育15分钟.
- 用3ml洗涤液 (PBS + 0.1% NaN3 + 5% FBS) 洗涤一次.
- 300-350 x g离心5分钟，弃上清，再涡旋使细胞完全重悬.
- 加入100ul B液（破膜剂）和适量体积的胞内抗体或相应同型对照.
- 涡旋1-2秒，室温下避光孵育20分钟.
- 用3ml洗涤液 (PBS + 0.1% NaN3 + 5% FBS) 洗涤一次.
- 300-350 x g离心5分钟，弃上清，再涡旋使细胞完全重悬.
- 用鞘液重悬细胞并及时上机分析，或用0.5ml 0.1%多聚甲醛固定，2–8°C避光保存，并在18个小时内对固定完的细胞进行分析.
甲醇改进法
甲醇改进法建议用于细胞周期抗原如BrdU、Ki-67和PCNA等的FITC偶联抗体检测。当使用RPE偶联抗体检测时不推荐使用此方法.
- 对于每个待分析的样品，加入100ul细胞（约1 x 106个细胞），调整体积到5ml，12 x 75 mm管.
- 加入100ul A液（固定剂），室温下孵育2-3分钟.
- 加入4ml预冷的（0–4°C）无水甲醇并涡旋混匀.
- 0–4°C孵育10分钟.
- 300–350 x g离心5分钟，使用洗涤液 (PBS + 0.1% NaN3 + 5% FBS) 洗涤.
- 加入100ul B液（破膜剂）和适量的胞内抗体或相应同型对照.
- 低速涡旋1-2秒，室温孵育30分钟.
- 使用3ml洗涤液 (PBS + 0.1% NaN3 + 5% FBS) 洗涤一次.
- 300–350 x g离心5分钟，弃上清.
- 用鞘液重悬细胞并及时分析，或用0.5ml 0.1%多聚甲醛固定，2–8°C避光保存，并在18个小时内对固定完的细胞进行分析.
非常重要:血液样本必须保存在肝素管中.
- 分别向两个12 x 75 mm扣盖管中各加入0.5ml肝素化的全血样本.
- 向每管中加入0.5ml RPMl 1640（无添加剂），使得最终体积为1ml.
- 第一管中，加入10ug布雷菲德菌素A（20ul用无水乙醇稀释的浓度为0.5 mg/mL的布雷菲德菌素A储存液，在–20°C下保存），轻轻混匀，这管代表静止细胞群.
- 第二管中，加入10ug布雷菲德菌素A，25ng PMA（2.5ul溶解在DMSO中的浓度为1 mg/mL的PMA储存液，RPMI 1640（无添加剂）1:100稀释，在–20°C下保存），1 µg离子霉素（1ul溶解在DMSO中的浓度为1 mg/mL的离子霉素储存液，在–20°C下保存），轻轻混匀. 此管代表 活化细胞群.
- 在湿度7.5%二氧化碳培养箱中37°C孵育4小时.
- 在孵育的最后，混匀细胞，并分装到各12 x 75 mm 扣盖管中各100ul.
- 细胞中加入5 µL相应抗体进行细胞表型鉴定（细胞表面染色）（例如，D3-TRI-COLOR、CD4-TC、CD8-TC、CD45-TC或CD69-TC，进行三色染色实验；或者FITC 和RPE进行双色实验分析）.
- 室温下避光孵育15分钟.
- 缓缓加入100ul FIX & PERM试剂盒的A液，室温避光孵育15分钟.
- 使用洗涤液 (PBS + 1 % BSA，0.1 % NaN3，1 % FBS) 洗涤两次。第二次洗涤时，细胞沉淀已不再牢固，因此需谨慎，以防细胞丢失.
- 洗涤完的细胞加入100ul FIX & PERM试剂盒的B液和1–10µL每种抗细胞因子抗体或同型对照.
- 室温下孵育20分钟.
- 使用洗涤液洗涤两次，并重悬细胞.
- 对SSC和FL-3设门进行分析（3色或4色实验）.
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FIX & PERM试剂由澳大利亚An Der Grub Bio Research GmbH为Thermo Fisher Scientific生产。
仅供研究。不适用于诊断。