介绍

通过αβ-T细胞受体(TCR复合物)激活T细胞是 T细胞体外扩张 所必需的。使用单克隆抗 CD3 抗体和抗 CD28 抗体刺激 T 细胞，产生共刺激信号，与TCR共同实现抗原诱导的活化。如下所述，使用功能级抗体（无论是否具有生长因子）是一种更经济的 T 细胞扩增方法。用于 T 细胞扩增和活化的Human T-Activator CD3/CD28 也可用于活化和扩增人 T 细胞。PMA 或伴刀豆球蛋白 A 能在短时间内促进细胞表达转录因子和细胞因子，因此有利于流式细胞术分析和免疫检测。


材料

  1. 经无菌细胞培养处理的 6 孔板（例如 Nunc 经细胞培养处理的 6 孔板，货号：140675）
  2. 15 mL 锥形管（例如 Nunc 15 mL无菌 锥形离心管，货号：339650）
  3. 抗 CD3（例如功能级抗人 CD3（OKT3），货号：16-0037-81，或功能级抗小鼠 CD3 单克隆抗体（17A2），货号：16-0032-82）
  4. 抗 CD28 抗体（例如功能级抗人 CD28 单克隆抗体（CD28.2），货号：16-0289-81，或功能级 CD28 单克隆抗体（37.51），货号：16-0281-82）
  5. RPMI 1640 培养基（例如 BenchStable RPMI 1640 培养基，货号：A4192301 或 OpTmizer T 细胞扩增，货号：A3705001）
  6. 胎牛血清（例如 Gibco 胎牛血清，货号：26140087）
  7. 左旋谷氨酰胺（例如 200 mM 左旋谷氨酰胺，货号：25030149）
  8. 可选：青霉素-链霉素（例如 Gibco 青霉素-链霉素，货号：15140148）
  9. 磷酸盐缓冲液（例如 Gibco PBS (10X)，pH 7.4，货号：70011044）
  10. 细胞刮刀（例如 Nunc 细胞刮刀，货号：179693）


步骤

  1. 准备 6 孔培养板，前 3 孔贴上“已活化 T 细胞”标签，后 3 孔贴上“未活化 T 细胞”标签。
  1. 用无菌 PBS 稀释抗 CD3 抗体（浓度为 1 µg/mL），然后在“已活化 T 细胞”孔中包被抗 CD3 抗体。向前 3 个孔中加入稀释后的抗体（2 mL/孔）。将培养板放入 5% CO2 培养箱中，在 37°C 下孵育 2 小时。
  1. 将胎牛血清（最终浓度达 10%）和 2 mM 左旋谷氨酰胺添加到RPMI 1640 培养基（如果未使用 GlutaMAX 补充的培养基），即配制完成RPMI 1640 完全培养基。使培养基的温度达到 37°C。 可选：添加 1% 的青霉素-链霉素到培养基（5000 单位/mL）。
  1. 在无菌条件下，从全血或淋巴组织中分离 PBMC（分别见下面的补充方案 A 或 B）。
  1. 用RPMI 1640 完全培养基重悬细胞，使其浓度达 3 x 106 个细胞/mL。
  1. 将细胞溶液平均分到 2 个锥形管中；一个锥形管贴上“已活化”标签，另一个锥形管贴上“未活化”标签。
  1. 向“已活化”锥形管中加入 5 µg/mL 的抗 CD28，然后放到培养箱中（室温）。
  1. 2 小时后，从培养箱中取出 6 孔板。吸出抗 CD3 溶液并丢弃。不要清洗培养板。
  1. 将标有“已活化”的细胞溶液（来自步骤 7）平均分到 6 孔板上经抗 CD3 处理的孔（“已活化T 细胞”）中（每孔 2-3 mL）。
  1. 将标有“未活化”的细胞溶液平均转移到 6 孔板上未经处理的孔（“未活化 T 细胞“）中（每孔 2-3 mL）。
  1. 将培养板放入 5% CO2培养箱中，在 37°C 下培养 1-3 天。第 1 天，细胞会产生转录因子和细胞因子。大多数 T 细胞会在 3 天内分裂。这些细胞会形成团块，但不会附着在培养板上。
  1. 用细胞刮刀收集细胞。

方案提示：

应根据经验确定抗 CD3 和抗 CD28 抗体的最佳浓度范围。抗 CD3（小鼠和人）的最佳浓度范围为 1-3 µg/mL；抗 CD28（小鼠和人）的最佳浓度范围为 3-5 µg/mL。

方案提示：

IL-2 会促进细胞毒性 T 细胞的生长和分化。加入 100 ng IL-2 重组蛋白（货号：PHC0026）来代替抗 CD28，有助于 T 细胞扩增。

方案提示：

为节省时间，可在步骤 3 中向培养基中直接加入抗 CD3，终浓度为 1 µg/mL。

方案提示：

可以拓展方案：使用 T75 烧瓶，使其适用于更大的细胞数量。


补充方案 A：从全血中分离 PBMC

材料

  1. 磷酸盐缓冲液（例如 Gibco PBS (10X)，pH 7.4，货号：70011044）
  2. 15 mL 或 50 mL 锥形管（例如 Nunc 15 mL 无菌锥形离心管，货号：339650）
  3. Ficoll-Paque® 密度分离培养基
  4. 流式染色缓冲液（例如 eBioscience 流式染色缓冲液，货号：00-4222-26）

步骤

  1. 在锥形管中，按至少 1:1 的比例使用 PBS 稀释血液样本。
  1. 往稀释的样本中加入与原始样本等体积的 Ficoll-Paque® 。
  1. 在室温下 400 x g 离心 20 分钟。
  1. 将 PBS 和 Ficoll-Paque® 层交界处的 PBMC 收集至新的试管中。
  1. 向试管加入 PBS，洗涤细胞。
  1. 在 2-8°C 下300-400 x g 离心 4-5 分钟，丢弃上清液。
  1. 用适量的流式染色缓冲液或专用缓冲液重悬细胞，然后进行细胞计数和活性分析。
  1. 重复步骤6对细胞进行离心，并用适量的RPMI 1640 完全培养基重悬，使细胞终浓度达到 3 x 106 个细胞/mL。

注意：

如果细胞将用于培养，全程应采用无菌技术和使用不含叠氮化物的缓冲液。

方案提示：

使用自动计数仪显著提高了单核细胞健康和浓度评估的准确度。有关如何使用 Countess II FL 自动细胞计数仪对 PBMC 进行计数， 见详细方案。

补充方案 B: 从淋巴组织中分离免疫细胞因子

材料

  1. 60 x 15 mm 细胞培养皿（例如 Nunc 皮氏细胞培养皿，货号：150340）
  2. 3 mL 塑料注射器或两个带毛玻璃的载玻片
  3. 细胞筛网（尼龙网）
  4. 15 mL 或 50 mL 锥形管（例如 Nunc 15 mL 无菌锥形离心管，货号：339650）
  5. 流式染色缓冲液（例如 eBioscience 流式染色缓冲液，货号：00-4222-26）

步骤

  1. 将组织（脾脏、胸腺、淋巴结）收集至含有 10 mL 流式染色缓冲液或专用缓冲液的细胞培养皿中。使用 3 mL 注射器柱塞按压组织，使其分离成单细胞悬液。或者使用 10 mL 流式染色缓冲液，将组织置于两个载玻片的磨砂面之间磨碎。
  1. 将细胞筛网放在 15 mL 锥形管顶部。转移细胞通过细胞筛网上，以去除细胞团块和碎片。
  1. 在 2-8°C 下 300-400 x g 离心 4-5 分钟。丢弃上清液。
  1. 用适量的流式染色缓冲液或专用缓冲液重悬细胞，然后进行细胞计数和活性分析。
  1. 重复步骤3对细胞进行离心， 然后用适量RPMI 1640 完全培养基重悬细胞，细胞终浓度达到 3 x 106 个细胞/mL。

备注：

一般来说，机械性破坏淋巴组织足以制备单个细胞悬液。

备注：

如果细胞将用于培养，全程应采用无菌技术和使用不含叠氮化物的缓冲液。

仅供科研使用，不可用于诊断目的。