凝膠阻滯分析（EMSA）

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EMSA技術是基於以下觀察結果：當進行非變性聚丙烯醯胺（Polyacrylamide）或瓊脂糖凝膠電泳時，蛋白質–DNA複合體的遷移速度比游離的線性DNA片段來的更慢。因為與蛋白質結合時，DNA遷移速率會發生偏移或延遲，因此該檢測方法也稱為凝膠遷移或凝膠阻滯分析。

對於蛋白質–DNA複合體的解析能力，大幅取決於複合體在每個步驟中的穩定性。在電泳過程中，蛋白質–DNA複合體迅速從游離DNA中分離出來，提供了原始樣品中結合DNA和游離DNA之間平衡的"速寫"。凝膠基質提供了一種"Caging"效應，有助於穩定交互作用複合體：即使交互作用複合體的成分解離，它們在局部的濃度仍然很高，因而可迅速促進重新結合。此外，電泳緩衝液的離子強度相對較低，有助於穩定瞬時交互作用，甚至允許透過這種方法解析及分析不穩定的複合體。

在線性DNA片段上形成的蛋白質–DNA複合體，會導致在凝膠中的特徵性遷移阻滯。然而，如果使用環狀DNA（如長度200-400 bp的小環），蛋白質–DNA複合體實際上可能比游離DNA遷移得更快，類似於電泳過程中，觀察超螺旋（Supercoiled）DNA與缺口（Nicked）或線性質體DNA相比較時所得情況。與某些蛋白質因子結合而導致的DNA構象改變或彎曲，也非常適合利用凝膠遷移測定來解析。凝膠阻滯分析不侷限於分析蛋白質–DNA交互作用。相同的電泳原理也可用於研究蛋白質–RNA和蛋白質–胜肽交互作用。

凝膠阻滯分析方法概述。凝膠阻滯分析法包括三個關鍵步驟：(1)結合反應，(2)電泳，(3)探針檢測。結合反應中的成分添加順序往往很關鍵。結合反應完成後最好立即進行電泳，以保存潛在的不穩定複合物來進行檢測。這個理想化的例子顯示，加入特異性競爭劑或蛋白特異性抗體，以完全消除蛋白質–探針複合體。然而，僅觀察到強度的降低，而非條帶的完全消失。

通常情況下，EMSA使用材料為包含感興趣結合序列的線性DNA片段。如果目標DNA片段很短（20-50 bp）且定義明確，則可以經濟實惠地合成帶有特定序列的互補寡核苷酸，並降溫黏合以形成雙鏈體。對於大多數應用和序列而言，寡核苷酸的標準脫鹽所產生的純度已足夠讓EMSA使用。然而，對於形成堅固二級結構或具有長重複片段的序列，可能需要進行凝膠或HPLC純化，以確保大部分產物具備實驗可用的正確長度和序列。

為了分析蛋白質–DNA的交互作用，當其涉及具多蛋白質結合位點的多重蛋白質複合體，通常會使用較長的DNA片段。這些較大的片段（100-500 bp），通常來自於含目標序列克隆的質體所得的限制性片段或PCR產物。在這種情況下，必須對所需的DNA片段進行凝膠純化，並透過限制性酶切或定序以取得驗證。標準沉澱或脫鹽不會移除產生片段的酶，而剩餘的質體或模板DNA通常會在測定過程中導致非特異性條帶或競爭性結合。

如果在EMSA反應中使用大量的DNA，則可以透過溴化乙錠染色（Ethidium bromide staining）或其他DNA螢光染色來觀察DNA條帶。然而，在大多數EMSA結合反應中所使用的載體和非特異性競爭DNA也會被染色，並導致高背景信號。這種檢測方法通常有大量的DNA需求，以有利（且經濟實惠）在結合反應中使用低濃度的DNA來限制非特異性結合。因此，更常見的方法是在實驗之前對探針進行標記，以便在電泳後對其進行特異性檢測。傳統上，利用Klenow片段的3'端填充反應期間加入[γ-³²P]dNTP，或於5'末端使用[γ-³²P]ATP和T4多核苷酸激酶，將DNA探針以³²P進行放射性標記。電泳之後，將凝膠暴露於X射線底片以記錄結果。

由於放射性的相關費用和監管考量，許多實驗室已轉而尋求替代EMSA檢測系統。因為dNTPs可利用半抗原（Hapten，如生物素和地高辛）或螢光染劑修飾，所以有許多非放射性的方法可用於執行EMSA。藉由合適的成像系統，可以在凝膠中對螢光探針進行檢測，但因為儀器昂貴，而且其靈敏度尚不能與放射性探針相比，這種方法迄今還不是很流行。

半抗原修飾的DNA探針可以透過二級檢測試劑（如鏈黴親和素或抗DIG抗體），在類似於western blotting的酶受質系統中進行視覺化觀察。此方法唯一需要的額外步驟，是將分離的蛋白質和DNA樣品轉移到適當的膜支持載體上。當與適當的受質一起使用時，生物素–鏈黴親和素系統非常穩固，可以進行優化以達到與放射性探針相同的偵測極限（Detection limit）。值得注意的是，使用核苷酸進行此類印跡分析，需要使用帶正電荷的膜以捕獲和固定小片段核酸。儘管這種類型的膜在封閉和非特異性結合方面存在某些技術挑戰，但這些可透過優化的試劑盒來克服。例如，Thermo Scientific Pierce RNA 3'末端生物素化試劑盒，可針對標記RNA探針的3'起始端進行優化，以促進它們在EMSA和其他蛋白質–RNA交互作用研究方法中作為探針或目標物使用。

RNA的3'末端標記。以T4 RNA連接酶，對RNA的3'-OH與生物素化胞苷二磷酸（Biotinylated cytidine bisphosphate，來自於Pierce RNA 3'末端生物素化試劑盒）的相連進行催化。這種生物素標記物允許使用avadin蛋白進行檢測。使用該試劑盒可對RNA探針的3'末端標記。

非特異性競爭劑是任何不相關的、未標記的核酸，在結合反應中作為封閉劑/淬滅劑使用，以最小化非特異性蛋白質與標記的目標DNA相結合。DNA凝膠阻滯分析中最常見的非特異性競爭劑，是經超聲處理的鮭魚精子DNA和poly(dI•dC)。這些重複的片段或聚合物提供了過量的非特異性位點，用於吸附在粗裂解溶液中與任何DNA序列相結合的蛋白質。在結合反應中添加這種試劑的順序很重要，為了將其效能最大化，在加入標記的DNA目標物之前，必須將競爭DNA與提取物一起添加到反應當中。

特異性競爭劑是一項重要的對照，用於驗證由蛋白質與標記探針結合所產生的條帶特異性。特異性競爭劑通常具有與標記探針相同的序列，或包含目標蛋白的已知共有結合序列。一般來說，超過200倍莫耳量的未標記探針足以勝過與相同標記探針的任何特異性交互作用，從而消除或減少任何正位移結果。相反的，在一個優化的實驗系統中，添加過量的突變體或含低親和力結合位點的無關序列，將不會與特異性交互作用競爭，並且會保留移位的條帶。與非特異性競爭劑一樣，未標記的特異性競爭劑必須在標記的探針之前加入反應，但在非特異性競爭劑與蛋白質作用之後再添加。

添加順序對非特異性交互作用的影響。根據探針的序列和其他DNA結合蛋白的呈現，添加的順序會影響凝膠遷移測定中的非特異性結合。當最後添加Oct-1或 AP1的探針時，阻止了非特異性條帶的產生。然而，HeLa提取物在最後被加入時（在探針之後），儘管每個反應中都包含非特異性競爭DNA（poly(dI•dC)），但仍然出現非特異性條帶。當蛋白質提取物在最後加入反應中，非特異性結合會隨著特異性競爭劑的加入而持續存在。箭頭顯示為非特異性條帶的位置。

影響當下研究的蛋白質–DNA交互作用的強度和特異性的因素，包括結合緩衝液的離子強度和pH值、非離子清潔劑、甘油或載體蛋白質（如BSA）的存在、二價陽離子的存在/不存在（如Mg2+或Zn2+）、競爭DNA的濃度和類型，以及結合反應的溫度和時間。如果特定的離子、pH值或其他分子對結合反應中複合體的形成至關重要，則可能需要將其納入電泳緩衝液中以穩定交互作用進行，直至樣品進入凝膠基質。

因為不同的核酸結合蛋白具許多獨特要求，EMSA測定並沒有一套通用的反應條件。然而，EMSA為研究熱門交互作用目標物的常用流程，並且通常可從已發表的感興趣蛋白質研究文章中，查找到關於結合反應所需的資訊。如果無法取得先前研究工作的資料，則必須透過經驗確定反應條件。在這種情況下，最好根據研究中蛋白質類型或測試中探針內假定結合蛋白的共有序列，從一般性假設開始。例如，核激素受體通常需要配體才能啟動活化。另外，由於它們是鋅指蛋白（Zinc-finger protein），所以核激素蛋白需要鋅離子才能發揮作用。因此，在結合反應中可能需要蛋白質配體和鋅離子。此外，在建立創新型核激素受體的結合反應時，可能需要避免使用強螯合劑，如EDTA和EGTA。

根據蛋白質與探針結合的要求，另一個重要的考慮因素是如何將樣品加入凝膠之中。通常，將甘油或Ficoll*（GE Healthcare）添加到結合反應中以增加樣品的密度，使其在上樣時沉入井（well）中。如果電泳指示劑（Loading agent）不作為結合反應的一部分添加，則可以在上樣之前立即添加。溴酚藍（Bromophenol blue）通常被添加到染劑中，以便在上樣過程中對其進行觀察。溴酚藍也可作為示踪染劑（Tracking dye），以監測電泳的整體進程。需要注意的是，溴酚藍和其他染劑可與蛋白質結合，並抑制預期的結合反應。因此，如果出現問題，樣品有/無示蹤染劑和結合反應的測試就十分重要。在這種情況下，可以將示踪染劑上樣到沒有結合反應的通道，或者加入無蛋白質的樣品中。

非變性TBE-聚丙烯醯胺（TBE-polyacrylamide）凝膠或TAE-瓊脂糖凝膠（TAE-agarose）用於將蛋白質–DNA複合體從游離DNA中分離出來。傳統上，大尺寸凝膠用於解析EMSA反應，但小型凝膠搭配最長約300 bp的探針，通常反應效果相當好，具體則取決於相關的蛋白質複合體。帶有小結合蛋白質的大型探針，可能需要更長的凝膠以充分解析任何陽性遷移。凝膠百分比需求取決於目標DNA的大小，以及結合蛋白質的大小、數量和電荷。重要的是，讓蛋白質–DNA複合體進入凝膠，而不是滯留於上樣孔的底部。實驗通常會使用4-8%範圍的聚丙醯酰胺凝膠，儘管較高百分比的凝膠與小探針和複合體一同使用的情況很常見。瓊脂糖凝膠（0.7–1.2%）可用於解析非常大的複合體，例如大腸桿菌RNA聚合酶（~460 kDa）。

凝膠遷移圖譜。此圖表顯示了不同類型和百分比的Novex 聚丙烯醯胺凝膠中，核酸的分離模式。

雖然特異性蛋白質與目標DNA結合會導致特徵性遷移，但遷移率的相對變化無法鑑定移位複合體中的結合蛋白質。鑑定與探針結合的蛋白質，通常透過在結合反應中加入對假定DNA結合具有特異性的抗體來完成。如果感興趣蛋白質與目標DNA結合，抗體將與該蛋白質–DNA複合體結合，進一步降低其相對於未結合DNA的遷移率，即所謂的"supershift"。在某些情況下，抗體可能會破壞蛋白質–DNA的交互作用，導致特徵性遷移的消失，但不會引起"supershift"。遷移條帶的消失和"supershift"的缺失是一個負面結果，但若與適當的對照組一起使用時，它可以輔助對感興趣蛋白質的鑑定。"Supershift"反應不必侷限於抗體，也可以包括其他二級或間接結合的蛋白質。

進行supershift實驗，會對結合反應的建立產生了額外考量。抗體和結合參與者可能有特定的添加順序需求。例如，某些抗體如果在複合體形成之前添加，可能會阻止蛋白質與DNA的結合。用於產生supershift的抗體和其他蛋白質，可能無法在蛋白質–DNA遷移複合體的最佳結合緩衝液中發揮作用。許多核蛋白在還原條件下，對遷移複合體擁有良好功能。因此，濃度為1 mM或更高的DTT經常被添加到EMSA結合緩衝液中。然而，許多抗體在還原條件下功能降低，甚至失去功能。如果可以，在凝膠遷移測定中選擇已知作用的抗體。此外，對western blotting有效但無法使用於ELISA的抗體（即僅能用於檢測變性蛋白質），不太可能用於supershift測定。

另一項鑑定過程是執行"shift–western blot"的組合。這個過程涉及將分離的蛋白質–DNA複合體，轉移到層疊的硝化纖維素膜和陰離子交換膜上。硝化纖維素膜上捕獲的蛋白質可以利用特異性抗體（Western blot）探測，而陰離子交換膜上捕獲的DNA則可以透過放射自顯影術（Autoradiography）或化學發光技術進行檢測。

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