HPLC 方法開發逐步說明
要開發穩健、可再現且可靠的 HPLC 或 UHPLC 方法可能很麻煩，即使是經驗豐富的液相層析操作人員亦然。本影片將說明正確開發 LC 方法所需的所有步驟。
樣本製備
HPLC 方法開發
相關資源
製備方法 | 分析原理 | 應用 |
稀釋 | 降低樣本中的分析物、溶劑或基質濃度 | 防止管柱/偵測器過載，減少樣本溶劑洗脫強度 |
離心 | 根據密度沉澱 | 從溶液中去除大的細胞成分 |
過濾 | 去除樣本中的微粒 | 延長管柱使用壽命，防止流路堵塞 |
蛋白質沉澱 | 透過添加鹽、溶劑或更改 pH 值來析出蛋白質 | 去除溶液中的蛋白質 |
液體對液體萃取 | 根據兩種可混溶之溶劑的溶解度差異來分離樣本成分 | 根據極性/電荷來純化化合物 |
固相萃取 | 使用吸附固定相進行目標分析物的選擇性分離/純化 | 由生物基質分離出小分子，大型生物分子脫鹽 |
免疫親合性捕捉 | 使用抗體選擇性純化分析物 | 由生物/環境/食品與飲料基質分離出小分子 |
蛋白質消化 | 蛋白質經酵素分解為胜肽 | 產生胜肽以供進行由下而上的蛋白質體學/胜肽圖譜 |
衍生化 | 改變分析物物理化學特性的化學反應 | 改善分析物滯留、穩定性或可偵測性 |
大小排阻 | 根據大小分離樣本成分 | 蛋白質緩衝液交換/脫鹽、大分子去除 |
均質化 | 使用機械力分解固體樣本結構 | 破碎生物組織、環境樣本，以改善萃取 |
多步驟程序包括均質化、液體對液體萃取、離心、固相萃取 | 從食品和環境樣本中萃取出殺蟲劑 |
基質效應
樣本基質是什麼？
您可以將樣本基質想為除了關注的分析物以外樣本中的任何物質，包括鹽、其他化合物及溶劑。基質類型可以決定樣本製備、層析模式和檢測方法。瞭解樣本基質是方法開發的基本考量。
基質效應是什麼？
基質效應是一個廣義術語，描述特定分析物基質改變分析物偵測或定量的傾向。此效應通常會造成偏差，並導致低估或高估溶液中現有分析物的濃度。
基質效應幾乎可以出現在分析的任何階段，包括樣本製備、管柱分離和偵測。以下是幾個一般範例：
- 共同洗脫出 UV 吸收化合物與目標分析物
- 樣本 pH 改變可電離分析物的滯留係數
- 電霧電離時分析物發生離子抑制
如何減少干擾基質
有幾種常見的方法可以減少基質效應。正確的選擇取決於分析的具體特性。
如果分析物靈敏度足夠，最直接的方法是將樣本稀釋於適當的注射溶劑中。較稀的樣本基質效應較可忽略。
其他解決方案包括在分析前先萃取，排除可能的樣本污染源，以改善分離效果。使用 2D-LC 或改用選擇性較高的偵測方法也可以避免基質效應。
最後，您可以進行標準添加而不改變方法。但是，由於每種樣本的注射次數增加，通常不採用這種技術。
方法步驟
方法開發步驟
如果沒有既定的方法，則必須謹慎規劃和執行才能開發穩健的程序。除了製備樣本之外，建立 HPLC 或 UHPLC 方法時，還需要知道 四個主要步驟 ：
方法探勘。包括篩選各種管柱和洗脫條件。此階段的目的是選擇成功進行 HPLC 分離的最佳組合。在實務上，方法探勘需要大量的手動操作來切換管柱和移動相，以及建立儀器方法。如能瞭解目標分析物特性，即可在最初僅探勘幾個最有希望的候選管柱。
方法最佳化。包括對 HPLC 方法的各種分離條件進行反覆測試，此步驟目標為達到最佳可能解析度、速度和再現性。這個步驟是方法開發最耗時的部分，通常需要專業知識才能完美完成。
穩健性測試。用以確定改變分離方法參數的影響。對許多方法開發與驗證程序來說，最佳化穩健性至關重要。
方法驗證。判斷已開發分析方法是否符合所需應用的產業特定程序。
方法開發考量
在方法開發方面，有三個參數越來越重要：化合物滯留 (k)、效率 (N) 和選擇性 (a)。調整選擇性的一個常見方法是變更 管柱的化學特性 和洗脫液。如果手動進行此更換，這類工作通常會很耗時。幸運的是，現代技術可將這類程序自動化。
方法開發資源
要開發穩健、可再現且可靠的 HPLC 或 UHPLC 方法可能很麻煩，即使是經驗豐富的液相層析操作人員亦然。
在某些情況下，您可以搜尋 Thermo Scientific AppsLab 分析應用檔案庫，而完全無需進行方法開發。此線上資料庫包含數千個應用的可搜尋儲存庫，其中包含詳細的方法資訊和預先填入的 eWorkflow™ 程序。
另一個有助於定義起始方法參數的來源是美國藥典 (USP) 和歐洲藥典 (Ph.Eur.) 等已確立藥典的專論。
滯留行為、管柱效率與選擇性對兩種化合物層析解析度的影響
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自動化方法
自動化方法開發
開發 LC 方法仍是許多實驗室的瓶頸，而自動化方法開發是可節省大量時間與資源的程序。我們提供多種硬體與軟體工具，可加速方法開發程序、提升最終方法品質，並將開發時間從數週甚至數月縮短為數日。
方法探勘系統設定的流程圖
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方法開發硬體
自動化方法開發所需的兩項關鍵硬體功能為：
自動溶劑切換。這項技術讓您在連續過程中切換移動相，無需手動更換瓶子和清洗系統。Thermo Scientific Vanquish 方法開發系統包括一個帶外接式選擇閥的溶劑延伸套件，每通道可自動探勘高達 10 種溶劑。
自動管柱切換。用於早期方法開發，通常包括探勘幾種固定相化學物質。自動管柱切換功能無須因手動切換管柱接頭而造成暫停，可讓操作人員省時省力。 Thermo Scientific Viper 方法探勘套件 包含偵測四管柱化學物質時所需的所有流體連接通路和毛細管。
方法開發軟體
完全自動化的方法開發需要專門的軟體來引導從方法探勘到驗證的過程。數種套裝軟體包括從預測分析物滯留行為到產生序列等功能。
例如，ChromSwordAuto Chromeleon Connect 利用人工智慧進行方法最佳化。ChromSword AutoRobust Chromeleon Connect 使用多變量方法進行自動化方法穩健性和系統穩定性評估的簡化。這兩種選項都完全整合到 Chromeleon 中，提供流暢的使用者體驗。
與 Thermo Scientific HPLC 系統相容的另一款重要套裝軟體是 S-Matrix® Fusion QbD®，它主要以「品質源於設計」的方式進行方法開發。
常見問題
開發 HPLC 方法需要四個不同的步驟：方法探勘、方法最佳化、穩健性測試和方法驗證。
方法驗證是進行研究程序的正式及系統化過程，旨在確認 HPLC 方法合適且符合目的，在該方法所描述的限制範圍內提供令人滿意且一致的結果。
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