RT-qPCR的簡介

以RNA為起始材料

當起始材料為RNA時，可使用定量反轉錄PCR (RT-qPCR)進行分析。在這種方法中，RNA首先透過反轉錄酶（reverse transcriptase）從total RNA或messenger RNA（mRNA）轉錄成互補DNA（cDNA）。之後cDNA將作為qPCR反應的模板。RT-qPCR可用於各式應用，包括基因表現分析、RNAi驗證、微陣列驗證、病原體檢測、基因檢測和疾病研究。

一步法（One-step） vs. 兩步法（Two-step）RT-qPCR

RT-qPCR可以一步法（one-step）或者兩步法（two-step）檢測進行分析（圖1，表1）。一步法檢測同時運用反轉錄酶和DNA聚合酶，將反轉錄和PCR步驟結合於同一個試管與緩衝液中。一步法RT-qPCR僅使用序列特異性性引子。在兩步法檢測中，反轉錄和PCR步驟在各自的試管中進行，具備不同的優化緩衝液、反應條件與引子啟動策略。

圖1，一步法vs.兩步法RT-qPCR。

表1，在RT-qPCR中使用一步法與兩步法檢測的優缺點

 優點缺點
一步法
  • 由於兩種反應都在同一管中進行，因此實驗變異度較小。
  • 更少的移液步驟降低了污染風險。
  • 適用於高通量擴增/篩選。
  • 快速且高度再現性。
  • 無法各別對這兩個反應進行最佳化。
  • 靈敏度低於兩步法，因為反應條件是兩個反應組合的折衷方案。
  • 每個樣品可檢測的目標較少。
兩步法
  • 產生一個穩定的cDNA庫，可供長期儲存並可用於多種反應。
  • 目標基因和參考基因可以從同一個cDNA庫中擴增，無需多工處理。
  • 各單獨反應都擁有經優化的反應緩衝液和反應條件。
  • 靈活的引子啟動選擇。
  • 使用多個試管與移液步驟，讓反應暴露於更高的DNA污染風險。
  • 耗費時間
  • 比一步法更多的優化需求。
RT-qPCR中的反轉錄步驟(Reverse Transcription)

Total RNA vs mRNA的選擇

當設計一個RT-qPCR檢測時，決定使用total RNA或是純化的mRNA作為反轉錄模板是很重要的。mRNA可能會提供稍高的靈敏度，但total RNA更常被使用，因為它作為起始材料而言比mRNA具有重要優勢。首先，因純化所需的步驟較少，而確保了更佳的模板定量回收，以及具備更好的能力將結果標準化為起始細胞數。其次，透過避免任何mRNA富集步驟，可以免除由於不同mRNA的回收率差異而導致結果偏差的可能性。綜合以上，total RNA在大部分情況下皆較適合使用，因為對於大多數應用而言，目標的相對定量比檢測的絕對靈敏度更為關鍵1。

反轉錄步驟的引子

在兩步法檢測中啟動cDNA反應可採用三種不同的方式：oligo (dT)引子、隨機引子，或序列特異性引子（圖2，表2）。通常情況下會使用oligo(dT)s和隨機引子的混合物。這些引子與模板mRNA鏈降溫黏合後，為反轉錄酶提供一個合成的起點。

圖2，RT-qPCR兩步法檢測中，用於反轉錄步驟(reverse transcription)的四種不同引子方法。

表2，RT-qPCR中cDNA合成步驟的引子注意事項。隨機引子和錨定oligo(dT)引子的結合提高了反轉錄效率與qPCR靈敏度。

引子選擇結構與功能優點缺點
Oligo(dT)s (或錨定oligo(dT)s)引子胸腺嘧啶殘基與mRNA的poly(A)尾部降溫黏合後延伸；錨定oligo (dT)在3'末端含有一個G、C或A（錨定）殘基。
  • 可從poly(A)尾端mRNA生成全長cDNA。
  • 如果可用的起始材料很少，則非常適用。
  • 錨點確保oligo(dT)引子結合於mRNA的poly(A)尾部5'端。
  • 僅擴增poly(A)尾部的基因。
  • 由內部poly(A)引發位點*2截斷cDNA。
  • 偏向3'端*。
*如果使用錨定oligo(dT)，則可將其最小化。
隨機引子長度為六到九個鹼基，它們沿著RNA轉錄本在多個位點進行降溫黏合。
  • 可與所有RNA（tRNA、rRNA和 mRNA）進行降溫黏合。
  • 非常適用於具重要二級結構的轉錄本，或在可用的起始材料很少的情況。
  • cDNA產量高。
  • cDNA由所有RNAs來源製成，這並非全然理想，且mRNA信號將被稀釋。
  • cDNA會被截斷。
序列特異性引子可針對特定mRNA序列設計客製化引子。
  • 特定的cDNA庫。
  • 靈敏度更高。
  • 使用反向qPCR引子。
  • 僅能合成一個感興趣的基因。

反轉錄酶的作用

反轉錄酶是以RNA為模板合成DNA的酶。某些酶具有RNase活性，可在轉錄後降解RNA-DNA複合體中的RNA鏈。如果一種酶不具備RNase活性，可以添加RNaseH以提高qPCR效率。常用的酶包括莫洛尼小鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus）反轉錄酶和禽類成髓細胞瘤病毒（Avian myeloblastosis virus）反轉錄酶。對於RT-qPCR來說，選擇具有高熱穩定性的反轉錄酶是最理想的，因為允許在更高溫的環境下進行cDNA合成，以確保成功轉錄具高品質二級結構的RNA，同時在整個反應過程中保持其完整活性，以達成更高的cDNA產量。

反轉錄酶的RNase H活性

RNase H的活性將RNA從RNA-DNA雙螺旋中降解，從而有效合成雙股DNA。然而，對於較長的mRNA模板，RNA可能會過早地被降解，導致截斷的cDNA。因此，當目的在產生用於cDNA cloning的長轉錄本時，盡可能降低RNase H的活性通常是有益的。相較之下，具備內在RNase H活性的反轉錄酶在qPCR應用中時常受到青睞，因為它們在PCR的第一個循環中增強了RNA-DNA雙螺旋的熔解（圖3）。

圖3，反轉錄酶的RNase H活性。在qPCR中，使用具有RNAse活性的反轉錄酶。

熱循環儀中的cDNA合成

如果RNA模板具有高度的二級結構，建議採用此步驟。

建議採用此步驟來擴展引子。

反轉錄酶利用mRNA模板來合成互補DNA鏈。

本步驟可防止活性反轉錄酶對qPCR反應的抑制。

Step 1 : 預變性（可選）

如果RNA模板具有高度的二級結構，建議採用此步驟。

Step 2 : 引子延伸

建議採用此步驟來擴展引子。

Step 3 : cDNA合成

反轉錄酶利用mRNA模板來合成互補DNA鏈。

Step 4 : 反應終止

本步驟可防止活性反轉錄酶對qPCR反應的抑制。

RT-qPCR中的qPCR

引子設計

理想情況下，用於RT-qPCR之qPCR步驟的PCR引子，應設計為可跨外顯子-外顯子接合處（exon-exon junction），且其中一個擴增引子可能跨越實際的外顯子-內含子邊界（圖4）。這種設計降低了因擴增污染的基因組DNA而造成的偽陽性風險，因為含有內含子的基因組DNA序列不會被擴增。

如果不能設計引子來分離外顯子或外顯子-外顯子邊界，則必須採用無RNase的DNase I或dsDNase來處理RNA樣品，以去除污染的基因組DNA。

RT-qPCR的對照組

所有的RT-qPCR實驗中都應包含一個減去反轉錄的對照組（-RT對照），以檢測是否有DNA污染（例如基因組DNA或前一次運作後的PCR產物）。這種對照組包含除了反轉錄酶以外的全部反應成分。在此對照中不應該發生反轉錄，因此如果觀察到PCR擴增，它很可能來自於污染的DNA。

圖4，RT-qPCR之qPCR步驟的引子設計。 1) 如果一種引子被設計可跨越外顯子-內含子邊界，則可能的污染基因組DNA就不會被擴增，因為引子無法與模板降溫黏合。反之，因cDNA不包含任何內含子，所以可有效地啟動與擴增。 2) 當引子側面與長內含子（例如1 kb）相接時，擴增不會發生，因為短的延伸時間對於短cDNA序列來說足夠，但對於較長的基因組目標而言是不夠的。

參考文獻

  1. Bustin S. (ed) (2004) A-Z of Quantitative PCR. IUL Biotechnology Series, International University Line, La Jolla, California.

 

僅供研究用途，不得用於診斷程序。