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siRNA概述
根据您的目的基因，在转染后数小时即可测定mRNA水平。我们建议在转染48小时后检测mRNA的敲低效果。影响检测时间的因素包括转录活性，信使RNA的降解速度，以及是否存在替代通路。要确定敲低的峰值，最好进行一个时间梯度实验。
请参考以下可能的原因和建议：
- 是检测的mRNA水平吗？最可靠的方法是实时PCR。在一些情况下，即使mRNA已经被敲低，蛋白的敲低效果也可能会受蛋白降解速率等其它变量的影响。
- RNA是如何提取的？检测提取的RNA的质量了吗？应确保RNA没有降解。
- 使用阳性对照了吗？这可以帮助确定试剂是否有效以及siRNA是否被正确递送进细胞。请在进行实验的同时使用阳性对照siRNA。
- 使用转染对照了吗？被转染细胞的百分比是多少？
- 进行不同时间的检测了吗？通常，基因沉默可以早在转染后24小时测定。但是，基因敲低的持续时间和程度取决于所用的细胞类型和siRNA的浓度。
- 优化过转染条件吗？您可以尝试使用不同的细胞密度和siRNA浓度。
- 您使用了多大浓度的siRNA？我们建议测试 5 nM到100 nM之间的多个浓度。
请参考以下可能的原因和建议：
- 您测试了多少个siRNA？有任何敲低效果吗？如果所有siRNA都没有敲低效果（<10%），那么可能是检测方法本身的问题。试试使用其他qRT-PCR assay评估敲低效果。
- qRT-PCRassay的靶位点和siRNA切割位点的相对位置如何？如果两者相差3,000碱基以上，问题可能是其它剪接转录本的存在造成的。
- 实验的Ct值是多少？在40循环的qRT-PCR实验中它们应该低于35。
- 您确定siRNA转染进入细胞中了吗？我们建议使用一个经过验证的阳性对照siRNA来检查转染效率。
在一些情况下，即使mRNA已经被敲低，蛋白的敲低效果也会受蛋白降解速率等其他变量的影响。另外，相比于mRNA，蛋白可能需要更长的时间才能看到敲低效果。
我们建议进行一个转染试剂对照实验，确定您的细胞是否对转染试剂敏感。此外，您可以尝试其他细胞密度和siRNA浓度以减少转染本身的毒性。请访问我们的转染支持中心获取更多关于转染的问题排查信息。
请查看下列内容：
(a) Silencer Select: “ThermoFisher Scientific”向您担保，如果您针对同一靶基因购买了两条预设计的Silcencer SelectsiRNA，这两条siRNA对靶基因mRNA的敲低效果均能够达到70%或更多。此担保的前提条件是，siRNA转染的终浓度必须≥5nM，且在转染后48小时测定mRNA水平。建议采用实时定量RT-PCR技术检测mRNA水平，但不做强制性要求。客户还必须提供阳性对照的有效敲低结果，从而证明转染效率是足够的。如未能检测到我们承诺的敲低水平，而阳性对照的结果是成功的，我们将会免费为您合成一条新的Silencer Select siRNA。此担保未延伸至任何换货产品。”
(b) StealthRNAi: “ThermoFisher Scientific”向您担保，如果您针对同一靶基因购买了三条预设计的stealth siRNA，这三条独立的非重叠的siRNA之中至少有两条对靶基因mRNA的敲低效果能够达到70%或更多。此担保的前提条件是，siRNA转染的终浓度必须≥20 nM，且在转染后48小时测定mRNA水平。建议采用实时定量RT-PCR技术检测mRNA水平，但并不是强制的。客户还必须提供阳性对照的有效敲低结果，从而证明转染效率是足够的。如果未能检测到我们承诺的敲低水平，而阳性对照的结果是成功的，我们将会免费为您合成一条新的StealthsiRNA。此担保未延伸至任何换货产品。我们还建议您使用适当的阴性对照（如三种Stealth™ RNAi阴性对照之中的一种）来标准化mRNA敲低水平。”
(c) Silencer: “ThermoFisher Scientific”向您担保，如果您针对同一靶基因购买了三条预设计的SilencersiRNA，其中至少有两条能够将培养细胞内的靶基因mRNA水平降低70%或更高（转染时siRNA的终浓度≥100 nM，转染后48小时检测，实验条件如下所述）。如果三条之中至少有两条对靶基因mRNA的敲低效果未能达到70%以上，ThermoFisher Scientific将会免费一次性更换每个基因最多三条预设计的SilencersiRNA。产品更换申请必须在预设计的SilencersiRNA发货后一百八十(180)天内提出。您必须遵照良好的实验操作和靶向内源基因的经验证的siRNA（例如，Ambion Silencer GAPDH对照）来确保最佳的转染效率。为了评估敲低效果，预处理样品内靶基因的mRNA水平，必须与转染不靶向任何基因的对照siRNA（例如 Silencer阴性对照1）的细胞内的靶基因mRNA水平进行比较。我们建议采用TaqMan基因表达assay定量mRNA水平。”
所有经验证的siRNA每条均有质保条款，保证其对目标mRNA的敲低效果达到80% (Silencer) 或 70% (Stealth RNAi).
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.