基于TALEN的基因组编辑支持 - 入门

TALs或者TALENs是类似于转录激活因子的效应核酸酶蛋白，它们是天然存在的转录激活因子，由Xanthomonas spp.分泌到其植物宿主体内。 Invitrogen™ GeneArt™ TALs来源于细菌Xathomonas产生的TAL效应子，其DNA结合结构域包含不同数目的氨基酸重复序列。每个重复包含33-35个氨基酸并可识别一个单DNA碱基对。对DNA的识别是通过两个高变异氨基酸残基实现的，它们分别位于每个重复序列的第12和13位，被称为重复可变双残基（repeat-variable di-residues, RVD）。TAL效应子重复序列可以通过模块的形式组装，通过改变RVD而生成一个识别特定目标DNA序列的TAL蛋白。

1) 每个重复序列内的两个关键氨基酸和目标序列内的每个DNA碱基是一一对应的关系

2) 通过简单编码即可生成基因工程TAL蛋白

3) 比锌指蛋白更具可预测性

4) 结构域的模块化组装可以生成序列特异性的DNA结合蛋白

5) 可以通过编码对特定位点行使某种功能如：核酸酶，激活因子，抑制因子，染色体修饰因子

Invitrogen™ GeneArt™ Precision TALs除了可用于基因删除、基因下调和整合之外，还可以用于基因激活。此外，该系统是基于一个蛋白-DNA系统，而CRISPR是基于一个RNA-DNA系统。TALs效应子可以用于靶向包括哺乳动物、细菌、酵母、植物、昆虫、干细胞以及斑马鱼在内的任何细胞的任何基因。最后，使用TAL系统时脱靶效应更低。

请参考下列论文，文中作者比较了TALEs技术和CRISPR技术。

我们在您的订单确认后大约两周内可将一个经过验证和序列优化的克隆发出。

请查看下列可用的效应结构域。

以下是我们的建议：

GeneArt Precision TALs允许构建针对18或24个碱基对的DNA靶标的TAL效应子功能性蛋白。

每个目标位点必须在5’末端之前有一个碱基T，因为TAL效应子蛋白包含一个保守的T-结合基序。该5’T不包含在被选作特异性靶标的18或24个碱基中。

一对核酸酶需要被设计为在互补DNA链上的各自目标位点之间有13-18 bp的间隔序列。下图可作为参考以确定结合结构域的方向（图A）。

对于Invitrogen™ GeneArt™ PerfectMatch TALs而言，5’末端碱基没有限制。我们通过突变N端结构域以降低其对5’T的特异性从而研发出了第二代的TALs。因此，5’端出现任何碱基（T, G, C, 或A）都可以，且其性能表现和最初的GeneArt Precision TALs相当。我们建议您在设计一对核酸酶时，它们各自识别的目标位点之间应有一段15–16 bp的间隔序列。

因为存在强DNA结合基序和弱DNA结合基序，DNA结合结构域内每个结合基序对于TAL效应子结合DNA效率的贡献是不同的。A和T结合基序被认为属于“弱结合”基序，而C和G结合基序被认为是“强结合”基序。应该避免在结合结构域（不包括5’T）的5’末端出现5个连续的弱结合基序，也应避免5个连续的弱结合基序两侧不是C的情况。

我们建议您选择一个针对混合结合基序组成的结合结构域的TAL效应子以获得最佳结果。在活细胞中，DNA的开放程度也会影响TAL效应子的效率。染色质、DNA甲基化，和/或与DNA结合的蛋白都可能影响TAL的结合。

尽管启动子的结构各异，并且目前还缺乏特定的设计规则，但是我们建议将用于激活天然启动子的TAL转录因子设计在TATA-box的上游，或者在某些情况下将其置于转录起始位点下游。不建议将目标位点选择在跨TATA-box或其它已知转录因子结合位点区域。确保具有天然存在的ATG，并且没有转录出上游的其它ATG，否则可能干扰天然转录的起始。

GeneArtPerfectMatch TALs来源于GeneArt Precision TALs。GeneArtPerfectMatch TALs采用了一个新的设计以去除5’端碱基限制，因此可以被设计为靶向基因组内的任何序列。它们在TAL效应子的N末端带有3个氨基酸的突变，从而将5’结合基序转变为一个通用结合基序，可以结合任意碱基：A，G，C或T。这些PerfectMatch TALs可以是带有Fok1核酸酶的Invitrogen™ Gateway™入门载体，也可以是可在哺乳动物系统表达的带有CMV启动子的表达载体。PerfectMatch TALs的表现和最初的Precision TALs一样或更好。目前，GeneArtPerfectMatch TALs仅提供带有核酸酶功能的形式（Fok1核酸酶对），而Precision TALs提供核酸酶功能（Fok1核酸酶对），激活子功能（VP16或VP64），抑制子功能（KRAB），或者定制功能（MCS载体）。

我们使用 Invitrogen™ GeneArt™ Genomic Cleavage Detection试剂盒比较了针对HPRT位点设计的GeneArtPerfectMatch和Precision TALs的切割效率，并且发现对于相同目标区域GeneArtPerfectMatch TALs表现出和GeneArt Precision TALs相同或更好的性能。

GeneArtPerfectMatch TALs提高了设计TAL效应子的灵活性，并使得一对TAL效应子间保持15–16 bp的间隔成为可能，从而获得了最大的TAL效应子效率。

我们提供N-TAL Fok1Gateway入门载体或Fok1 CMV启动子驱动表达的载体。

最近由Prashant Mali发表在Nature Biotechnology上的研究指出TALENs可以接受1-2碱基的错配，但不太能接受大多数3碱基的错配。

TAL载体为3.3 kb。

是的。如果基于病毒的导入方法是你的首选，那么我们建议使用腺病毒系统而非慢病毒系统进行TAL的导入。

通过仔细的设计可以构建非常特异的TALs。最近发表的文章显示TALs可以在很大程度上接受目标DNA序列内的1-3碱基的错配。

我们通常在收到您订单后2周内开始制造您的TAL载体。

对于标准测试细胞系（如293，Hela等）导入mRNA和DNA的最佳方法是基于脂质体的转染。导入mRNA也可以降低转基因整合的风险。我们提供用于导入mRNA的产品包括Invitrogen™ Lipofectamine™ MessengerMAX™ 试剂，用于导入DNA的产品包括Invitrogen™ Lipofectamine™ 3000 试剂。对于干细胞，电转是最好的选择。

是的，KO和KI涉及到在需要的位点通过突变或删除遗传信息或插入新的信息编辑原始的遗传编码。尽管这一技术确实是对原始遗传信息的操作，但如果运用恰当,，它将非常有用，例如遗传操作酵母菌以生产胰岛素或者对细胞进行遗传工程操作以获得更经济和临床上更有价值的产品。

1. 为目标DNA设计GeneArt TALs，然后将其克隆到Gateway™入门载体或目的载体
2. 体外验证TALs（可选）
3. 用TAL表达载体转染细胞
4. TAL介导的目标DNA切割
5. 使用GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit分析切割效果

请根据标准的质粒DNA转染步骤进行操作。我们建议您使用我们的Lipofectamine 3000和Lipofectamine 2000试剂。请看下图显示的使用Lipofectamine 3000 或2000试剂转染GeneArt Precision TALs或CRISPR的效果。

所有TALs都作为入门克隆进行表达（兼容于Gateway克隆，两侧带有attL1和attL2位点）。

1. Fok1 TALs：

带有Fok1核酸酶的TALs可以被用于靶向沉默特定基因。

Fok1是一种来源于Flavobacteriumokeanokoites的二型限制性内切酶，它包含一个N端DNA结合结构域和一个C端非特异性DNA切割结构域。

Fok1作为成对的核酸酶发生作用，它在结合结构域指定的目标位点结合DNA双链并切割DNA。

2. VP16或VP64 TALs：

VP16或VP64均可以用于提高内源或重组基因的表达水平。

VP16是一种来源于单纯疱疹病毒的反式作用蛋白，它可以和宿主转录因子形成复合体以诱导早期基因的快速转录。

VP64是VP16最小活性结构域的四联体。

3. KRAB TALs

KRAB抑制子可以用于下调/抑制内源或转入基因的表达。

4. MCS TALs

多克隆位点（MCS）TAL可以用于克隆任何需要的效应子结构域以便靶向修饰基因组内的任意位点。

使用一对与Fok1内切核酸酶融合的GeneArt Precision TAL蛋白可以在基因组特定位点使双链断裂。使用一对Precision TAL蛋白可以降低脱靶效应。Fok1核酸酶结构域产生的双链切口将由两种细胞内源机制中的一种修复：非同源末端连接（nonhomologous end joining, NHEJ），或同源重组修复（homology-directed repair, HDR）。NHEJ倾向于错误修复并且在修复蛋白编码基因的编码区域时经常会引入移码突变，从而高效的导致基因沉默。同源DNA“供体序列”可以用于HDR修复以引入一段新的DNA序列。因此，与Fok1内切核酸酶融合的GeneArt Precision TAL蛋白可以用于诱导基因沉默或在基因组的特定位点精确插入一段设计好的DNA片段。

不，我们推荐脂质体介导的转染或电转染。请查看相关文献或咨询您所用细胞系的提供者以获知优化的转染方法。

请发电子邮件到我们的团队，地址是lifescience-CNTS@thermofisher.com.

我们建议您将载体重悬于50 µL蒸馏水或10 mMTris-HCl (pH 8.0)缓冲液中，室温孵育1小时。轻轻吹打5-10次以重悬载体DNA。将重悬后的DNA存储在–20°C。

是的，KO和KI涉及到在需要的位点通过突变或删除遗传信息或插入新的信息编辑原始的遗传编码。尽管这一技术确实是对原始遗传信息的操作，但如果使用恰当，它将非常有用，例如遗传操作酵母菌以生产胰岛素或者对细胞进行遗传工程操作以获得更经济和临床上更有价值的产品。

GeneArt™ 基因组切割筛选试剂盒可以用于：

• 转染后最快24小时即可使用荧光显微镜筛选您的重组核酸酶的有效性
• 使用流式细胞分选（FACS）或Invitrogen™ Dynabeads™ CD4磁珠富集被修饰的细胞

试剂盒内的载体带有一个被用于克隆重组核酸酶靶标序列的克隆位点打断的OFP基因。编码OFP基因N端的上游序列包含一个和OFP基因C端区域5’末端互补的部分。N端OFP序列之后的终止密码子保证了在核酸酶工作之前没有报告基因的表达。在OFP基因被克隆位点打断时CD4基因位于读码框之外因而不表达。双链断裂导致OFP基因互补的末端序列之间进行重组，从而恢复了OFP的表达。CD4基因这时也位于读码框之内而被表达出来并可以通过FACS分析或Dynabeads磁珠分选进行筛选。

是的，GeneArtGenomic Cleavage Selection试剂盒既可用于TALs也可用于CRISPR载体。

请看下表所列的比较：

转染后最快24小时即可使用显微镜观察细胞内OFP的表达以确认是否发生切割。OFP阳性细胞的百分比指示了TAL或CRISPR-Cas9系统的切割活性。

GeneArt基因组切割筛选载体还包含通过T2A自剪切肽段与OFP融合的CD4膜蛋白，从而允许通过细胞分选或CD4抗体偶联的Dynabeads对经核酸酶编辑的细胞进行富集。该切割选择载体实现了对重组核酸酶功能进行简单、快速的评估，以及对基因组编辑后的细胞进行直接富集。

OFP和CD4表达仅是对基因组切割的一种估计而不是绝对定量。我们建议使用我们的GeneArtGenomic Cleavage Detection试剂盒验证内源基因组位点的切割。

OFP的激发峰为548 nm，发射峰为560 nm。推荐使用488 nm激光进行有效激发。推荐使用标准530/30, 574/26和603/48发射滤光片进行检测。

基因编辑后的细胞群体的一个样本被用来作为直接PCR的模板并使用特异性针对目标区域的引物进行扩增。然后对PCR产物进行变性和重新退火，由于双链断裂处引入了插入或缺失突变，有和无突变的PCR产物间会形成杂合错配。这些错配能被Detection Enzyme识别并切割。而这些切割很容易被检测到并可使用凝胶分析进行定量。

请使用下列公式：

样本通常使用琼脂糖凝胶例如Invitrogen™ E-Gel™ EX 凝胶进行电泳，然后使用图像软件或微流控电泳进行分析。