环介导等温扩增，也称为 LAMP ，是一种简单而又经济高效的核酸扩增技术，无需使用昂贵的仪器，可快速获得检测结果且可轻松解读。该技术之所以具有高性价比，是因为其在恒定温度下完成，不需要热循环仪或其他昂贵的检测设备。LAMP 可用于检测可能引起食品污染和植物疾病的各种病原体，包括细菌、病毒和原生动物。
了解环介导等温扩增技术的强大功能
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LAMP 和 RT-LAMP 相关的酶及试剂
Invitrogen LAMP 产品有单酶和预混液形式可供选择，可进行快速、高灵敏度和高特异性的 LAMP 反应，且耐受反应抑制剂。还兼容实时定量检测和终点法检测。
Invitrogen Lyo-ready Bst DNA 聚合酶，优化 LAMP 反应
使用经基因工程改造的 Bst DNA 聚合酶可快速灵敏地检测多种病原体
Lyo-ready Bst DNA 聚合酶是 Bst DNA 聚合酶大片段的基因工程改造产物，其具有更快的反应速度、更高的灵敏度，以及对抑制剂更高的耐受能力。Lyo-ready Bst DNA 聚合酶在 LAMP 反应优化方面可提供较大的灵活性，可用于检测多种类型的病原体，包括人类腺病毒、麻疹 SARS-CoV2 以及其他病原体。
产品特点：
- 快速—可在 10 分钟内完成靶标扩增
- 灵敏—可检测低至 50 个拷贝的靶标
- 强劲—甚至可以从含抑制剂的 RNA/DNA 样品中进行靶标扩增
- 灵活—在 LAMP 或 RT-LAMP 反应优化方面提供较大灵活性
Lyo-ready Bst DNA 聚合酶的优势
快速：
Lyo-ready DNA 聚合酶的超快速度可在 LAMP 反应中在短短 10 分钟内提供靶标检测。在病毒和细菌病原体检测中，与其他市售的 Bst DNA 聚合酶相比，Lyo-ready Bst DNA 聚合酶能够以更快的速度扩增 DNA 和 RNA 靶标。
图 1.Lyo-ready Bst DNA 聚合酶能够以较快的速度对多种 DNA 靶标进行扩增。使用腺病毒 AdV41 合成 DNA 和 Mycoplasma pneumoniae 基因组 DNA 及其相应的引物组和 SYTO 9 绿色荧光核酸染料测定 LAMP 反应的扩增速度。NEB™ Bst 3.0, NEB™ Bst 2.0 Warmstart, Optigene™ GspSSD 2.0, ArcticZymes™ Isopol Bst+ 和 Lucigen™ Bst DNA 聚合酶均按照制造商推荐的方案使用。误差线表示从每个测试样品的三次独立重复实验中计算出的反应速度的标准偏差。
Lyo-ready Bst DNA 聚合酶在 RT-LAMP 反应中仅需 10 分钟即可快速进行病毒 RNA 扩增，在初始扩增步骤中使用 SuperScript IV 反转录酶。与其他市售的 Bst DNA 聚合酶相比，Lyo-ready Bst DNA 聚合酶显示出具有明显更快的反应速度。
图2.Lyo-ready Bst DNA 聚合酶能够以更快的速度检测多种 RNA 靶标。使用 SARS-CoV-2 合成 RNA 和麻疹病毒 RNA 、对应的引物对，以及用于实时检测的 SYTO 9 绿色荧光核酸染料，在 RT-LAMP 反应中测定扩增速度。NEB™ Bst 3.0，NEB™ Bst 2.0 WarmStart，Optigene™ GspSSD 2.0 和 ArcticZymes™ Isopol BST+ DNA 聚合酶均按照制造商推荐的方案使用。所有反应都添加了推荐的反转录酶。误差线表示从每个测试样品的三次独立重复实验中计算出的反应速度的标准偏差。
灵敏度高
Lyo-ready Bst DNA 聚合酶具有高灵敏度，可从有限的起始材料中进行扩增，或从含有低浓度靶标 DNA/RNA 的样品中进行扩增。相比其他市售 Bst DNA 聚合酶，Lyo-ready Bst DNA 聚合酶表现出明显更高的灵敏度。Lyo-ready Bst DNA 聚合酶在 LAMP 反应中可实现低至 50 拷贝的灵敏度。
图 3.从少量起始 DNA 中进行高灵敏度和可靠的扩增。Lyo-ready Bst DNA 聚合酶可在 LAMP 反应中扩增低至 50 个拷贝的 DNA 靶标。使用腺病毒 AdV41 合成 DNA 和 M. pneumoniae 基因组 DNA、对应的引物对，以及用于实时检测的 SYTO 9 绿色荧光核酸染料来测定扩增速度。NEB™ Bst 3.0，NEB™ Bst 2.0 WarmStart， Optigene™ GspSSD 2.0 ， ArcticZymes™ Isopol BST+ 和 Lucigen™ Bst DNA 聚合酶均按照制造商推荐的方案使用。误差线表示从每个测试样品的三次独立重复实验中计算出的反应速度的标准偏差。
图4.从少量起始 RNA 中进行高灵敏度和可靠的扩增。 Lyo-ready Bst DNA 聚合酶可扩增 LAMP 反应中低至 50 个拷贝的 RNA 靶标。使用 SARS-CoV-2 合成 RNA 和麻疹病毒 RNA、对应的引物对，以及用于实时检测的 SYTO 9 绿色荧光核酸染料来测定扩增速度。NEB™ Bst 3.0, NEB™ Bst 2.0 Warmstart, Optigene™ GspSSD 2.0, ArcticZymes™ Isopol Bst+ 和 Lucigen™ Bst DNA 聚合酶均按照制造商推荐的方案使用。误差线表示从每个测试样品的三次独立重复实验中计算出的反应速度的标准偏差。
耐受 LAMP 检测中的抑制剂
即使在经过彻底的样品纯化过程后， RNA 和 DNA 样品的纯度也可能不佳。Lyo-ready Bst DNA 聚合酶对来自 RNA/DNA 提取过程或生物样品本身的常见抑制剂具有出色的耐受性。
表2.常见的 LAMP 反应抑制剂及其来源
| 抑制剂 | 来源 |
|---|---|
| 乙醇、盐 | 样本制备 |
| 肝素、氯高铁血红素、尿素 | 血液、尿液 |
| 腐殖酸、木聚糖 | 土壤、植物 |
| 用于临床标本的转移培养基 | UTM |
图 5.Lyo-ready Bst 聚合酶在存在抑制剂的情况下仍然保持高性能。将抑制剂与 1000 拷贝的合成 AdV41 DNA 一起加入 LAMP 反应。通过使用 SYTO 9 Green 荧光核酸染料实时检测扩增产物，分析测定 LAMP 反应速度。检测时间的相对增加表明，与未添加抑制剂的对照反应相比，检测样品的检测时间发生了变化。误差线表示从每个测试样品的至少四个独立重复实验中计算出的反应速度的标准差。
使用 Lyo-ready RNaseOUT 重组 RNA 酶抑制剂来避免 LAMP 反应中的 RNA 降解
RNaseOUT 重组 RNA 酶抑制剂是胰腺型核糖核酸酶（如 RNase A）的一种强效非竞争性抑制剂，在多种应用中用于避免 RNA 被降解。RNaseOUT 重组 RNA 酶抑制剂是一种酸性蛋白，分子量为 52 kDa。RNaseOUT 可抑制 RNase A ， RNase B 和 RNase C
使用 SuperScript IV RT-LAMP 预混液加速病毒病原体的研究与监测
Invitrogen SuperScript IV RT-LAMP 预混液是一种基于反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）的解决方案，可以更快、更简单地检测病毒病原体，包括 SARS-CoV-2、流感、麻疹和其它病原体。该预混液可提供较大的灵活性，用于优化和加速病毒病原体的研究和监测。
产品特点：
- 更快–借助改进型 Bst DNA 聚合酶，仅需 5 分钟即可完成病毒病原体检测
- 高效–借助 SuperScript IV 反转录酶， 可在一步反应中将 RNA 反转录成 cDNA。
- 灵敏–借助 RNaseOUT 重组 RNA 酶抑制剂和经优化的缓冲液，增强了反应灵敏度和特异性
- 更简单–简化的实验流程：单管反应，仅需要一个 65℃ 的加热模块
- 灵活–可使用多种方法评估检测结果，包括实时定量检测方法和终点检测方法。
RT-LAMP 实验流程，用于病毒病原体检测试剂的开发。
图 6.RT-LAMP 检测流程示意图。使用 Invitrogen SuperScript IV RT-LAMP Master Mix 进行病毒病原体检测试剂开发的一般流程
SuperScript IV RT-LAMP Master Mix 的优点
快速：
SuperScript IV RT-LAMP Master Mix 具有更快的 RNA 扩增速度。借助改进型 Bst DNA 聚合酶可在 5 分钟内完成病毒病原体检测。
图7.SARS-CoV-2 RNA 的扩增速度。SuperScript IV RT-LAMP Master Mix 可快速进行 RNA 靶标扩增，即使针对低拷贝数靶标。使用合成的 SARS-CoV-2 RNA、相同的引物对（来自 Colorimetric ReadiLAMP™ 试剂盒，SARS-CoV-2，货号 A52539）和 SYTO 9 绿色荧光核酸染料在 Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5, 6 Flex 或 7 Flex 实时定量 PCR 系统上进行实时检测来测定扩增速度。NEB™ WarmStart LAMP Kit (DNA & RNA), Optigene™ GspSSD2.0 Isothermal Mastermix, 以及 Lucigen™ LavaLAMP™ RNA Master Mix 均按照制造商推荐的实验方案使用。所显示的数值是三次实验的平均值。
灵敏度
SuperScript IV RT-LAMP Master Mix 在检测低拷贝 RNA 方面表现出强大的能力，可在不到 10 分钟内检测低至 30 个拷贝。
图8.检测低拷贝 SARS-CoV-2 RNA 。SuperScript IV RT-LAMP Master Mix 可在不到 10 分钟的时间内扩增低至 30 个拷贝的 RNA 靶标。使用合成的 SARS-CoV-2 RNA、相同的引物对（来自Colorimetric ReadiLAMP™ 试剂盒，SARS-CoV-2，货号A52539）和 SYTO 9 绿色荧光核酸染料在 Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5, 6 Flex 或 7 Flex 实时定量 PCR 系统上进行实时检测来测定扩增速度。NEB™ WarmStart® LAMP Kit (DNA & RNA), Optigene™ GspSSD2.0 Isothermal Mastermix, 以及 Lucigen™ LavaLAMP™ RNA Master Mix 均按照制造商推荐的实验方案使用。所显示的数值是三次实验的平均值。
灵活性
SuperScript IV RT-LAMP Master Mix 可使用不同方法用来评估检测结果，包括实时定量方法和终点法。
图9.通过实时荧光 RT-LAMP 分析检测病毒 RNA 靶标。使用实时荧光定量 PCR 仪和 SYTO 9 染料 进行 RT-LAMP。反应时间为 60 分钟。在阳性反应中两条蓝色曲线显示早期扩增信号（< 15分钟）。深蓝色曲线代表纯化的临床 RNA 扩增，浅蓝色曲线相应代表合成的病毒 RNA 扩增。灰色曲线表示无模板对照中的晚期扩增信号。
DNA/RNA 检测应用
SuperScript IV RT-LAMP Master Mix 还可以检测 DNA 靶标，为病原体研究和监测提供更广泛的应用。
图10.DNA 靶标扩增。SuperScript IV RT-LAMP Master Mix 可用于扩增 DNA 靶标，并表现出卓越的扩增速度。使用合成的 SARS-CoV-2 RNA、相同的引物对（来自 Colorimetric ReadiLAMP™ 试剂盒，SARS-CoV-2，货号 A52539）和 SYTO 9 绿色荧光核酸染料在 Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5, 6 Flex 或 7 Flex 实时定量 PCR 系统上进行实时检测来测定扩增速度。NEB™ WarmStart® LAMP Kit (DNA & RNA), Optigene™ GspSSD2.0 Isothermal Mastermix, 以及 Lucigen™ LavaLAMP™ RNA Master Mix 均按照制造商推荐的实验方案使用。所显示的数值是三次实验的平均值。
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Invitrogen 单酶包括聚合酶、缓冲液和其他成分，以确保在反应构建方面具有较大的灵活性，以及开发 LAMP 和 RT-LAMP 应用检测的可行性。其可以以无甘油可冻干形式进行定制。
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