选择 PCR 酶进行扩增分析时需要提出的 3 个问题

有时您只需要检测 PCR 产物或估算其大小，例如在对小鼠进行基因分型或筛选重组克隆时。对于这种类型的常规 PCR 分析，您应该使用标准的热稳定 DNA 聚合酶（如 Taq DNA 聚合酶）来确认目的 DNA 存在与否。

但是，如果要执行克隆实验或下一代测序（NGS），那么准确性至关重要。为了确保准确进行 DNA 拷贝，请确保选择高保真 DNA 聚合酶。高保真 PCR 酶具有 3'-5’ 核酸外切酶校对活性。当结合错误匹配的碱基对时，DNA 聚合酶停顿，导致合成暂延。合成暂延 允许去除错误匹配的核苷酸并使用正确的核苷酸取代。

保持序列准确的 DNA 聚合酶的绝佳选择是 Thermo Scientific Phusion Plus DNA 聚合酶 。该酶具有高保真度，保真度大于 Taq DNA 聚合酶的 100 倍。对于更高的序列精度，可选择 Invitrogen Platinum SuperFi II DNA聚合酶[YZ1] [OF2] ，其保真度大于Taq DNA聚合酶的300倍。

当使用长链 DNA 模板时，您需要一种高效的 PCR 酶。在这种情况下，请选择具有高持续合成能力和高延伸率的聚合酶。合成能力代表在单个结合事件中 DNA 聚合酶可以结合的核苷酸数量。鉴于可处理核苷酸的数量，高合成能力的 DNA 聚合酶有助于长链模板的扩增。此外，高延伸率 DNA 聚合酶能够在更短的时间内扩增 DNA。具有高合成能力和延伸率的 PCR 酶可确保长链模板的有效 DNA 合成，并缩短循环时间。Platinum SuperFi II 和 Phusion Plus DNA聚合酶都可以以15-30秒/kb的速度合成高达20 kb的DNA。

或许您在凝胶上看到了不应该出现的条带。这些额外的条带可能是非特异性扩增的一个例子（见 图 1 ）。为了实现特定目标条带的高产率扩增，选择热启动PCR酶，如Platinum II Taq或DreamTaq热启动DNA聚合酶。。只有当初始变性步骤达到 90°C 时，热启动 DNA 聚合酶才开始扩增。此功能有助于确保 PCR 反应不过早引发，得到不想要的非目标产物。此功能还有助于防止引物二聚体的形成，这在多重PCR和高通量 PCR 分析时特别有用。

还有更多需要考虑的因素。选择可以简化您工作流程的聚合酶形式。PCR 聚合酶形式的选择包括即用型预混液、用于直接凝胶上样的含染料缓冲液以及用于直接 PCR 分析的所有必要成分的完整试剂盒。

使用预混液，您只需添加模板和引物，然后，开始PCR 实验。如果您想进一步减少操作步骤，使用含染料缓冲液的聚合酶允许 PCR 产物直接凝胶上样（注意：确保染料与下游应用兼容）。直接 PCR 试剂盒还可以帮助节省时间，使您跳过 DNA 纯化步骤，直接进行 DNA 扩增。尽管有这些选择，如果您想优化反应的特定组分，请使用单独的 DNA 聚合酶。

当您评估 PCR 实验所需的准确度、速度和特异性时，您就可以在品类繁多的 PCR 酶市场中可靠地选择适用于您分子生物学分析的适合 DNA 聚合酶。